乳脂球膜细胞器及其制备方法技术

本发明专利技术提供了一种乳脂球膜细胞器，包括含过表达重组膜蛋白的动物乳腺上皮细胞的两层磷脂细胞膜结构，动物乳腺上皮细胞的细胞质结构，内部的脂肪球及动物乳腺上皮细胞的内质网外膜结构。所述重组膜蛋白嵌合于所述动物乳腺上皮细胞的两层磷脂细胞膜结构，使得膜蛋白分泌至乳汁后能自然嵌合于乳脂球膜的磷脂双分子层，不影响乳腺上皮细胞的正常功能，表达量高，能维持膜蛋白的正常生物学功能，从而使乳脂球膜细胞器能用于膜蛋白的生物学功能验证，以代替目前常用的膜蛋白过表达细胞系。本发明专利技术还提供了一种乳脂球膜细胞器的制备方法，该方法简单快速，无需借助昂贵仪器设备就能实现乳脂球膜细胞器的快速高效生产和重组膜蛋白的高水平表达。高水平表达。高水平表达。

【技术实现步骤摘要】
乳脂球膜细胞器及其制备方法


[0001]本专利技术涉及生物医药
，尤其涉及一种乳脂球膜细胞器及其制备方法。

技术介绍

[0002]GPCR(G Protein
‑
Coupled Receptor)，即G蛋白偶联受体，其主体由7段跨细胞质膜的α螺旋结构构成。N端和三个loop位于胞外，参与蛋白与其受体的相互作用；C端和3个loop位于胞内，其中C端和第3个loop(C3)在GPCR与下游G蛋白的相互作用从而介导胞内的信号传导过程中发挥重要的作用。GPCR由超过800个成员组成(其中约420种与嗅觉无关)，是哺乳动物基因组中最大的膜蛋白家族。GPCR广泛参与机体的发育和正常的功能行使。而与其相关的细胞内通路调节的异常，则会导致一系列疾病的发生。
[0003]针对GPCR的药物占全球治疗药物市场份额27％，2011
‑
2015年销售额约8900亿美元。截止2017年，共有475种针对108种GPCR的药物经FDA批准上市，占上市药物总数的34％。约有321个登记的临床试验，其中约20％靶向66个潜在的新GPCR靶点。目前，仅2例靶向GPCR的单抗获FDA批准上市，大于50％的人类基因组编码的非嗅觉GPCR(224种)尚无对应药物出现；孤儿GPCR受体的数量显著增加，已知约400种与嗅觉有关的GPCR中许多在全身广泛表达，具有嗅觉检测之外的重要功能。并且，也发现肿瘤细胞过度表达一些嗅觉感受器。
[0004]目前行业痛点在于GPCR和其他膜蛋白家族蛋白成员具有至少一次跨膜，以及其天然的低表达率的特点，使GPCR和其他膜蛋白抗原难以制备，抗体及小分子药物等筛选困难。细胞系表达GPCR和其他膜蛋白，存在表达量低，生产成本高等问题。
[0005]因此有必要提供一种新型的乳脂球膜细胞器及其制备方法，以避免现有技术中存在的上述问题。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种乳脂球膜细胞器及其制备方法，以解决细胞系表达GPCR和其他膜蛋白，存在表达量低，生产成本高等问题。
[0007]为实现上述目的，本专利技术所述乳脂球膜细胞器，包括：
[0008]含过表达重组膜蛋白的动物乳腺上皮细胞的两层磷脂细胞膜结构；
[0009]动物乳腺上皮细胞的细胞质结构；
[0010]内部的脂肪球及动物乳腺上皮细胞的内质网外膜结构。
[0011]本专利技术所述乳脂球膜细胞器的有益效果在于：可充分利用所述乳脂球膜细胞器分泌表达重组膜蛋白的独特之处，使所述重组膜蛋白分泌至乳汁后能自然嵌合于乳脂球膜的磷脂双分子层，不影响乳腺上皮细胞的正常功能，表达量高，能维持膜蛋白的正常生物学功能。从而可替代目前常用的GPCR和其他膜蛋白过表达细胞系，用于进行GPCR和其他膜蛋白的生物学功能验证。
[0012]优选的，所述重组膜蛋白包括并不限于GPCR、运输蛋白、连接蛋白、受体蛋白和酶类。其有益效果在于：可充分利用所述乳脂球膜细胞器分泌表达重组膜蛋白的独特之处，重
组膜蛋白分泌至乳汁后能自然嵌合于乳脂球膜(Milk Fat Globule Membrane，MFGM)的磷脂双分子层，不影响乳腺上皮细胞的正常功能，表达量高，能维持膜蛋白包括GPCR的正常生物学功能。
[0013]进一步优选的，所述重组膜蛋白包括GPCR。
[0014]进一步优选的，所述重组膜蛋白包括重组人CB1和重组人A2b，且所述重组人CB1的序列为SEQ ID No.1，所述重组人A2b的序列为SEQ ID No.2。
[0015]优选的，本专利技术的所述乳脂球膜细胞器的制备方法，包括步骤：
[0016]S1：提供含至少一种重组膜蛋白基因的核酸质粒；
[0017]S2：将所述核酸质粒导入雌性育龄非人哺乳动物基因中并将重组膜蛋白定位表达于所述雌性育龄非人哺乳动物的乳腺组织或乳腺管；或将所述核酸质粒转染至所述雌性育龄非人哺乳动物的乳腺组织或乳腺管；
[0018]S3：收集所述雌性育龄非人哺乳动物分泌的乳汁，从所述乳汁中获取并富集含过表达重组膜蛋白的乳脂球膜细胞器。
[0019]本专利技术所述乳脂球膜细胞器的制备方法的有益效果在于：制备方法简单快速，无需借助昂贵仪器设备就能实现所述乳脂球膜细胞器的快速高效生产和重组膜蛋白的高水平表达，取得了意想不到的技术效果。
[0020]优选的，所述步骤S2中将所述核酸质粒转染至所述雌性育龄非人哺乳动物的乳腺组织或乳腺管的步骤包括：将所述核酸质粒通过病毒转染或非病毒转染方式转染至所述雌性育龄非人哺乳动物的乳腺组织或乳腺管。
[0021]进一步优选的，所述步骤S2中将所述核酸质粒转染至所述雌性育龄非人哺乳动物的乳腺组织或乳腺管的步骤包括：将所述核酸质粒通过AAV病毒或其他病毒转染方式转染至所述雌性育龄非人哺乳动物的乳腺细胞。
[0022]优选的，所述乳脂球膜细胞器中的重组膜蛋白基因核酸质粒中所表达的重组膜蛋白分泌的信号肽编码序列选自乳清酸性蛋白、αS1
‑
酪蛋白、αS2
‑
酪蛋白、β
‑
酪蛋白、κ
‑
酪蛋白、β
‑
乳球蛋白、α
‑
乳清蛋白、人碱性磷酸酶、蜂毒素和免疫球蛋白轻链蛋白中的任意一种的序列，所述免疫球蛋白轻链蛋白为Igκ。其有益效果在于：有助于实现所述乳脂球膜细胞器的快速高效生产和重组膜蛋白的高水平表达。
[0023]进一步优选的，所述乳脂球膜细胞器中的重组膜蛋白基因核酸质粒中所表达的重组膜蛋白分泌的信号肽编码序列来自山羊β
‑
酪蛋白。
[0024]优选的，所述雌性育龄非人哺乳动物为小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、猪和牛中的任意一种。其有益效果在于：有助于实现所述乳脂球膜细胞器的快速高效生产和重组膜蛋白的高水平表达，表达量可达1
‑
10克/升以上，在奶兔1
‑
2周内可实现毫克级重组膜蛋白表达生产，在奶山羊3
‑
4周内可实现克级重组膜蛋白表达生产。
[0025]进一步优选的，所述雌性育龄非人哺乳动物为兔。
[0026]进一步优选的，所述雌性育龄非人哺乳动物为山羊。
[0027]优选的，所述步骤S3执行之后还包括步骤：用所述乳脂球膜细胞器进行膜蛋白的生物学功能验证，以替代目前常用的膜蛋白过表达细胞系。
附图说明
[0028]图1为本专利技术实施例的乳脂球膜细胞器的结构示意图；
[0029]图2为本专利技术实施例的乳脂球膜细胞器的制备方法流程图；
[0030]图3为本专利技术实施例1的动物乳汁样品通过SDS
‑
PAGE考马斯亮蓝染色法显示的重组人CB1的表达照片；
[0031]图4为图3所示的编号S1的样品通过蛋白质印迹法显示的重组人CB1的表达照片；
[0032]图5为实施例1的编号为S1的过表达重组人CB1并经常规祛酪蛋白初纯的动物乳汁样品与本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种乳脂球膜细胞器，其特征在于，包括：含过表达重组膜蛋白的动物乳腺上皮细胞的两层磷脂细胞膜结构；动物乳腺上皮细胞的细胞质结构；内部的脂肪球及动物乳腺上皮细胞的内质网外膜结构。2.根据权利要求1所述的乳脂球膜细胞器，其特征在于，所述重组膜蛋白包括并不限于GPCR、运输蛋白、连接蛋白、受体蛋白和酶类。3.根据权利要求2所述的乳脂球膜细胞器，其特征在于，所述重组膜蛋白包括重组人CB1和重组人A2b，且所述重组人CB1的序列为SEQ ID No.1，所述重组人A2b的序列为SEQ ID No.2。4.一种乳脂球膜细胞器的制备方法，其特征在于，包括步骤：S1：提供含至少一种重组膜蛋白基因的核酸质粒；S2：将所述核酸质粒导入雌性育龄非人哺乳动物基因中并将重组膜蛋白定位表达于所述雌性育龄非人哺乳动物的乳腺组织或乳腺管；或将所述核酸质粒转染至所述雌性育龄非人哺乳动物的乳腺组织或乳腺管；S3：收集所述雌性育龄非人哺乳动物分泌的乳汁，从所述乳汁中获取并富集含过表达重组膜蛋白的乳脂球膜细胞器。5.根据权利要求4所述的乳脂球膜细胞器的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中将所述核酸质粒转染...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄跃进，
申请(专利权)人：上海桀蒙生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：