生产重组目标蛋白的方法、过表达载体以及病毒悬液技术

本发明专利技术提供了一种生产重组目标蛋白的方法，包括：对包含目标蛋白的基因和腺相关病毒载体的过表达载体进行病毒包装后，将得到的病毒悬液通过腺相关病毒介导的转导方式导入临产的非人哺乳动物的乳腺组织或乳腺管中以完成病毒导入。本发明专利技术的生产重组目标蛋白的方法使用的所述过表达载体包含目标蛋白的基因和腺相关病毒载体，结合通过动物乳腺腺相关病毒介导的转导方式以完成病毒导入，无需借助昂贵仪器设备，有助于实现所述重组目标蛋白在动物乳汁的快速和高水平表达，取得了意想不到的技术效果。本发明专利技术还提供了所述过表达载体和所述病毒悬液。

【技术实现步骤摘要】
生产重组目标蛋白的方法、过表达载体以及病毒悬液
本专利技术涉及生物医药
，具体涉及生产重组目标蛋白的方法、过表达载体以及病毒悬液。
技术介绍
近年来，由于基因工程技术的不断完善和动物克隆技术的发展，动物乳腺生物反应器已成为研发非常活跃的领域。动物乳腺生物反应器通过将外源基因导入动物基因组中并定位将目标蛋白表达于动物乳腺，利用动物乳腺天然、高效合成并分泌目标蛋白的能力，在动物的乳汁中生产具有重要价值的生物产品。与基因工程细胞反应器相比，通过动物乳腺生物反应器得到的生物产品活性高、无污染，且易分离提纯，有利于降低成本。例如公开号为CN1247899A的中国专利技术专利申请公开了一种在动物乳腺内表达干扰素的重组DNA的构建方法，该方法向动物的乳腺导管直接注入包含重组DNA的注射液，使重组DNA进入乳腺分泌细胞，在分泌细胞分泌乳汁时，重组DNA所编码的蛋白得以表达。公开号为CN1744814A、CN101245351A和CN1869217A的中国专利技术专利申请都公开了利用腺病毒载体在动物乳汁表达药用蛋白的方法。公开号为US6743966B2的美国专利技术专利公开了一种利用动物乳腺生物反应器表达生产膜蛋白的方法，包括在非人哺乳动物的基因组插入乳腺特异表达构建物，促使膜蛋白在乳腺上皮细胞表达并分泌到乳汁中。然而，以上描述的利用动物乳腺生物反应器或腺病毒载体表达目标蛋白的周期通常较长，目标蛋白在每毫升乳汁中的表达水平通常无法达到毫克级，且现有技术中寻找乳腺导管入口需要在显微镜或放大镜下进行操作，一旦操作不当容易损坏乳腺导管。因此有必要提供新型的生产重组目标蛋白的方法，以避免现有技术中存在的上述问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种生产重组目标蛋白的方法以及应用于所述生产重组目标蛋白的方法的过表达载体以及病毒悬液，以实现所述重组目标蛋白的快速高效生产和高水平表达。为实现上述目的，本专利技术所述生产重组目标蛋白的方法包括：提供过表达载体，所述过表达载体包含目标蛋白的基因和腺相关病毒载体；对所述过表达载体进行病毒包装，以形成病毒悬液；将所述病毒悬液通过腺相关病毒介导的转导方式导入临产的非人哺乳动物的乳腺组织或乳腺管中以完成病毒导入，并使所述非人哺乳动物在泌乳过程中通过乳腺细胞表达和分泌所述重组目标蛋白；获取所述非人哺乳动物于泌乳期分泌的乳汁，从所述乳汁中获取所述重组目标蛋白。本专利技术的生产重组目标蛋白的方法的有益效果在于：使用包含目标蛋白的基因和腺相关病毒载体的过表达载体并进行所述病毒包装，然后利用得到的病毒悬液通过腺相关病毒介导的转导方式导入临产的非人哺乳动物的乳腺组织或乳腺管中以完成病毒导入，无需借助昂贵的仪器设备，通过简单操作就能够实现所述重组目标蛋白的快速高效生产和高水平表达，取得了意想不到的技术效果。优选的，所述过表达载体中的启动子序列为CMV、SV40、RSV、CAG和EF、乳清酸性蛋白(WAP)、αS1-酪蛋白、αS2-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白、β-乳球蛋白和α-乳清蛋白中的任意一种的序列。优选的，所述过表达载体中的增强子序列为CMV、SV40和RSV中的任意一种的序列。优选的，所述过表达载体中提供的所表达重组目标蛋白分泌的信号肽编码序列选自乳清酸性蛋白(WAP)，αS1-酪蛋白，αS2-酪蛋白，β-酪蛋白，κ-酪蛋白，β-乳球蛋白，α-乳清蛋白，人碱性磷酸酶，蜂毒素和免疫球蛋白轻链蛋白Igk中的任意一种的序列。进一步优选的，所述过表达载体中提供的所表达重组目标蛋白分泌的信号肽编码序列来自山羊β-酪蛋白的序列。优选的，所述重组目标蛋白为胆碱酯酶、过氧化物酶、生长激素、抗病毒蛋白、免疫球蛋白、病毒结构蛋白、类病毒颗粒和膜蛋白中的任意一种或所述任意一种的片段或衍生物。进一步优选的，所述重组目标蛋白为人乙酰胆碱脂酶和人丁酰胆碱酯酶中的任意一种。进一步优选的，所述重组目标蛋白为过氧化物酶、氧化酶和脱氢酶中的任意一种。进一步优选的，所述重组目标蛋白为膜蛋白，所述膜蛋白为GPCR蛋白，离子通道蛋白和转运蛋白中的任意一种。进一步优选的，所述重组目标蛋白为人ACE2和ACE2-Fc融合蛋白中的任意一种。优选的，所述过表达载体的序列还包含土拨鼠肝炎病毒转录调控元件序列（WPRE）和SV40聚腺苷酸化信号序列。优选的，所述过表达载体的序列如SEQIDNo.1-7中的任意一种所示。进一步优选的，所述过表达载体的序列结构为pAAV-CAG启动子-目标蛋白编码序列-WPRE-SV40聚腺苷酸化信号序列，所述过表达载体的核苷酸序列如SEQIDNo.1-4中的任意一种所示。进一步优选的，所述过表达载体的序列结构为pAAV-山羊β-酪蛋白基因（BCN）启动子-目标蛋白编码序列-WPRE-SV40聚腺苷酸化信号序列，所述过表达载体的核苷酸序列如SEQIDNo.5-6中的任意一种所示。进一步优选的，所述过表达载体的序列结构为pAAV-CMV启动子-目标蛋白编码序列-WPRE-SV40聚腺苷酸化信号序列，所述过表达载体的核苷酸序列如SEQIDNo.7所示。优选的，所述腺相关病毒载体血清型包括AAV1-AAV4和AAV7-AAV9中的任意一种。进一步优选的，所述腺相关病毒载体血清型为AAV1和AAV9中的任意一种。优选的，使用所述过表达载体、第一辅助质粒和第二辅助质粒对293T细胞进行共转染，然后对得到的转染液进行纯化处理，以完成所述病毒包装。进一步优选的，所述第一辅助质粒为pAAV-RC质粒，所述第二辅助质粒为pHelper质粒。优选的，所述病毒悬液的滴度不低于1×1012基因拷贝数/毫升。其有益效果在于：有助于所述重组目标蛋白的快速和高水平表达。优选的，所述临产的非人哺乳动物为距离预产期2-10天的健康的非人哺乳动物，并在进行所述病毒导入前，先对所述临产的非人哺乳动物进行麻醉。其有益效果在于：保证有关病毒能够感染乳腺细胞，使得所述重组目标蛋白通过泌乳过程分泌到乳汁中进行表达。进一步优选的，所述临产的非人哺乳动物为距离预产期2-4天的健康的非人哺乳动物。进一步优选的，还包括电刺激，所述病毒导入完成后，利用刺激装置对所述临产的非人哺乳动物的乳腺部位进行1-2分钟的所述电刺激，以有利于快速转染。优选的，所述非人哺乳动物为小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、猪和牛中的任意一种。本专利技术提供的所述过表达载体包含所述目标蛋白的基因和所述腺相关病毒载体，所述过表达载体用于通过病毒包装形成病毒悬液；所述病毒悬液用于通过腺相关病毒介导的转导方式导入临产的非人哺乳动物的乳腺组织或乳腺管中以完成病毒导入，并使所述非人哺乳动物在泌乳过程中通过乳腺细胞表达和分泌所述重组目标蛋白，以及通过获取所述非人哺乳动物于泌乳期分泌的乳汁，从所述乳汁中获取所述重组目标蛋白。本专利技术提供的所述病毒悬液由所述过表达载体经病毒包装形成。本专利技术提供的所述过表达载体和所述病毒悬液的有益效本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种生产重组目标蛋白的方法，其特征在于，包括：提供过表达载体，所述过表达载体包含目标蛋白的基因和腺相关病毒载体；对所述过表达载体进行病毒包装，以形成病毒悬液；将所述病毒悬液通过腺相关病毒介导的转导方式导入临产的非人哺乳动物的乳腺组织或乳腺管中以完成病毒导入，并使所述非人哺乳动物在泌乳过程中通过乳腺细胞表达和分泌所述重组目标蛋白；获取所述非人哺乳动物于泌乳期分泌的乳汁，从所述乳汁中获取所述重组目标蛋白。/n

【技术特征摘要】
1.一种生产重组目标蛋白的方法，其特征在于，包括：提供过表达载体，所述过表达载体包含目标蛋白的基因和腺相关病毒载体；对所述过表达载体进行病毒包装，以形成病毒悬液；将所述病毒悬液通过腺相关病毒介导的转导方式导入临产的非人哺乳动物的乳腺组织或乳腺管中以完成病毒导入，并使所述非人哺乳动物在泌乳过程中通过乳腺细胞表达和分泌所述重组目标蛋白；获取所述非人哺乳动物于泌乳期分泌的乳汁，从所述乳汁中获取所述重组目标蛋白。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述过表达载体中的启动子序列为CMV、SV40、RSV、CAG、EF、乳清酸性蛋白、αS1-酪蛋白、αS2-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白、β-乳球蛋白和α-乳清蛋白中的任意一种的序列。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述过表达载体中的增强子序列为CMV、SV40和RSV中的任意一种的序列。


4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述过表达载体中提供的所表达重组目标蛋白分泌的信号肽编码序列选自乳清酸性蛋白、αS1-酪蛋白、αS2-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白、β-乳球蛋白、α-乳清蛋白、人碱性磷酸酶、蜂毒素和免疫球蛋白轻链蛋白中的任意一种的序列，所述免疫球蛋白轻链蛋白为Igk。


5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述过表达载体的序列还包含土拨鼠肝炎病毒转录调控元件序列和SV40聚腺苷酸化信号序列。


6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述过表达载体的序列如SEQIDNo.1-7中的任意一种所示。


7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重组目标蛋白为胆碱酯酶、过氧化物酶、生长激素、抗病毒蛋白、免疫球蛋白、病毒结构蛋白、类病毒颗粒和膜蛋白中的任意一种或所述任意一种的...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄跃进，杨盼，粟子丹，张敬辉，
申请(专利权)人：上海桀蒙生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31