一种适用于猪的快速、高效的基因改造和转基因方法技术

本发明专利技术提供了一种适用于猪的快速、高效的基因改造方法，它是将基因编辑工具包装于3型或6型腺相关病毒，得到重组腺相关病毒，再将重组腺相关病毒注射入母猪输卵管。本发明专利技术的方法相比传统的体细胞核移植方法和胚胎显微注射方法，操作简便高效，基因改造效率高，极具应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种适用于猪的快速、高效的基因改造和转基因方法
本专利技术属于动物基因改造领域，尤其涉及一种适用于猪的快速、高效的基因改造方法。
技术介绍
出于提高猪的生产性能、增加猪的抗病能力，或者将其运用于医用器官移植的培养载体等等目的，适用于猪的基因改造技术逐渐凸显其应用价值。猪的基因改造技术主要包括2个部分，第一部分是基因编辑工具，具体来说，是具有基因编辑功能的质粒；第二部分是将基因编辑工具导入合子(受精卵或胚胎)的方法。早期的基因编辑工具，如：锌指核酸内切酶(zincfingernucleases，ZFNs)和转录激活子样效应核酸酶(transcriptionactivator-likeeffectornucleases，TALENs)技术工具，均存在操作步骤繁琐、载体构建时间长、打靶效率低、成本高昂等缺陷，限制了基因编辑猪的广泛应用。而规律性短重复回文序列簇(clusteredregulatoryinterspacedshortpalindromicrepeat，CRISPR)和CRISPR相关蛋白9(CRISPR-associated9，Cas9)构成的CRISPR/Cas9基因编辑工具是目前在基因编辑动物中广泛使用的基因编辑工具，其基本工作原理是：通过病毒载体向受体细胞导入根据靶序列设计的向导RNA(gRNA)和Cas9基因(如果受体细胞本身就能表达Cas9蛋白，则无需导入Cas9基因)，gRNA会与靶序列结合，Cas9基因表达的Cas9蛋白会结合到gRNA上，切段靶序列，此时细胞自带的DNA修复机制会将断裂上下游两端的序列连接起来，实现基因敲除；如果在此基础上引入用于修复的模板序列，细胞就会在修复过程中引入片段插入(Knock-in)或定点突变。CRISPR/Cas9基因编辑工具在大大提高基因编辑效率的同时还简化了相应的操作步骤。将基因编辑工具导入合子的方法，主流的有2种。一种是体细胞核移植，即先将基因编辑工具注射到猪的体细胞核，再将该细胞核注入成熟的去核卵细胞，再将得到的重组细胞植入子宫。另一种是胚胎显微注射，即将基因编辑工具注射到早期胚胎中，再将胚胎植入到子宫。这两种方法都存在如下缺点：1)需要显微注射，对技术人员的操作要求高，同时需要购买高昂的显微注射仪器，导致很多实验室无法开展实验；2)每次只能编辑一个胚胎，效率低，工作量极大，通常体细胞核移植需要移植上千个重组胚胎，显微注射需要使用上百个胚胎，并且耗费高昂；3)编辑的成功率低。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，提供一种适用于猪的快速、高效的基因改造和转基因方法。本专利技术的技术方案包括：一种基因改造猪的快速繁育方法，它是将基因编辑工具包装于3型或6型腺相关病毒，得到重组腺相关病毒，再将重组腺相关病毒注射入母猪输卵管，待母猪产下的小猪，即可获得基因改造猪；所述基因改造为：使猪原有的基因组序列发生碱基缺失、替换和/或序列插入。进一步地，所述基因编辑工具包括CRISPR/Cas9基因编辑技术所用到的表达gRNA的基因片段。进一步地，当母猪本身无法表达Cas9蛋白时，所述基因编辑工具还包括Cas9基因。进一步地，注射时间是母猪完成交配24h后，优选地，完成交配后24-30h。进一步地，注射病毒的剂量是(2-6)×1011GC，优选地，为4.5×1011GC。一种敲除猪的Rag2基因的方法，它是利用前述方法使猪的Rag2基因序列发生碱基缺失、替换和/或插入，使该基因无法正常表达。进一步地，所述gRNA带有如SEQIDNO.1或2所述序列。一种对猪转入外源基因的方法，其特征在于，它是将所述外源基因包装于3型或6型腺相关病毒，得到重组腺相关病毒，再将重组腺相关病毒注射入母猪输卵管，待母猪产下小猪，即可获得转入外源基因的小猪。。进一步地，注射时间是母猪完成交配24h后，优选地，完成交配后24-30h。进一步地，注射病毒的剂量是(2-6)×1011GC，优选地，为4.5×1011GC。本专利技术的技术方案具有如下有益效果：1)操作简单高效：无需在显微镜下进行操作，且一次可以对多个合子进行编辑；而现有的体细胞核移植或胚胎显微注射技术需要显微镜下操作，且单次只能编辑1个合子。2)编辑成功率高：Rag2基因敲除实验显示，本专利技术的方法可实现33.3％的基因敲除(等位基因双敲除)率；而现有的胚胎显微注射一般需要几十到上百个胚胎才能得到几只基因编辑的小猪，最常用的体细胞核移植则是需要移植上千个胚胎才可以得到几只基因编辑的小猪(Efficientbaseeditingformultiplegenesandlociinpigsusingbaseeditors，NatCommun.2019Jun28)。3)转基因效率高：EGFP实验显示，本专利技术的方法可实现66.6％的转基因效率。显然，根据本专利技术的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本专利技术上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。以下通过实施例形式的具体实施方式，对本专利技术的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本专利技术上述内容所实现的技术均属于本专利技术的范围。附图说明图1：流式细胞术检测图。图2：测序图。图3：荧光检测图。图4：PCR检测电泳图。图5：免疫组织化学检测图。具体实施方式实施例1利用6型rAAV(rAAV，重组腺相关病毒)携带CRISPR/Cas9基因编辑工具编辑巴马小型猪1.方法1.1基因编辑工具的包装合成靶基因gRNA正向链和反向链，退火形成带BbsI酶切粘性末端的双链DNA。正向链(SEQIDNO.1)和反向链(SEQIDNO.2)序列如下：5’-CACCGGCGATTGGTGACCAGATCC-3’(SEQIDNO.1)；5’-AAACGGATCTGGTCACCAATCGCC-3’(SEQIDNO.2)。然后使用T4连接酶克隆前述双链DNA至BbsI酶切后的pX601(Addgene107055，其内包含了Cas9基因)质粒载体中，获得pX601-gRNA质粒载体，；通过PCR扩增pX330(Addgene42230)质粒载体中的Cbh启动子，XbaI和AgeI双酶切pX601-gRNA质粒载体，切胶回收7630片段，通过INFUSION连接(Clontech)替换pX601-gRNA中的CMV启动子为Cbh启动子，获得pX601-Cbh-gRNA，测序验证载体后制备重组AAV病毒。纯化去内毒素质粒，通过pX601-Cbh-gRNA，pAAV2/6和pAdΔF6三质粒共转染293细胞，转染72h后裂解细胞收集病毒，碘克沙醇超速离心纯化病毒，定量qPCR测定病毒滴度。1.2将重组AAV病毒导入输卵管母猪完成交配后24-30h手术暴露输卵管本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基因改造猪的快速繁育方法，其特征在于，它是将基因编辑工具包装于3型或6型腺相关病毒，得到重组腺相关病毒，再将重组腺相关病毒注射入母猪输卵管，待母猪产下的小猪，即可获得基因改造猪；/n所述基因改造为：使猪原有的基因组序列发生碱基缺失、替换和/或序列插入。/n

【技术特征摘要】
1.一种基因改造猪的快速繁育方法，其特征在于，它是将基因编辑工具包装于3型或6型腺相关病毒，得到重组腺相关病毒，再将重组腺相关病毒注射入母猪输卵管，待母猪产下的小猪，即可获得基因改造猪；
所述基因改造为：使猪原有的基因组序列发生碱基缺失、替换和/或序列插入。


2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基因编辑工具包括CRISPR/Cas9基因编辑技术所用到的表达gRNA的基因片段。


3.如权利要求2所述方法，其特征在于，当母猪本身无法表达Cas9蛋白时，所述基因编辑工具还包括Cas9基因。


4.如权利要求1所述方法，其特征在于，注射时间是母猪完成交配24h后，优选地，完成交配后24-30h。


5.如权利要求1所述方法，其特征在于，注射病毒的剂量是(2-6)×1011GC；优选地，为4.5×1011GC。
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【专利技术属性】
技术研发人员：包骥，杨光，杨阳，步宏，高孟雨，廖光能，何宇婷，张炳琪，
申请(专利权)人：四川大学华西医院，
类型：发明
国别省市：四川;51