个性化癌症疫苗的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种个性化癌症疫苗的制备方法。具体地，本发明专利技术首次采用样本中分离富集CTC及其DNA和RNA或ctDNA和ctRNA至一定比例，利用背景细胞作为对照，分离和证实13‑20种能引起蛋白序列变化并能与人体HLA类型I或II受体及TCR紧密结合，还能活化CD8+T细胞或CD4+T辅助细胞的含肿瘤特异体细胞突变的DNA，RNA或短肽链，即肿瘤新生抗原(neoantigen)，有助于癌症的早期诊断；并且，在4‑6周内，制成个性化癌症疫苗，及时用于激发患癌对象的免疫反应。本发明专利技术能在几乎无创的情况下，准确、快速、高效地捕获能够激发抗癌免疫的抗原，减少了测序时间以及引入的误差，在肿瘤治疗领域具有广泛的应用前景。

Preparation of personalized cancer vaccine

The invention relates to a preparation method of a personalized cancer vaccine. Specifically, for the first time, the present invention separates and enriches CTC and its DNA and RNA or ctDNA and ctRNA to a certain proportion in samples, uses background cells as control, isolates and confirms 13 to 20 kinds of DNA, RNA or short peptide chains containing mutations of tumor-specific cells that can cause protein sequence changes and bind closely with human HLA type I or II receptors and TCR, as well as activate CD8+T cells or CD4+T helper cells. In addition, within 4 to 6 weeks, a personalized cancer vaccine was prepared to stimulate the immune response of cancer patients in a timely manner. The invention can accurately, rapidly and efficiently capture antigens capable of stimulating anti-cancer immunity, reduce sequencing time and introduce errors under almost non-invasive conditions, and has broad application prospects in the field of cancer treatment.

【技术实现步骤摘要】
个性化癌症疫苗的制备方法
本专利技术属于生物医药
，具体地，涉及个性化癌症疫苗的制备方法，具体地，涉及从患癌对象的体液中收集筛选含肿瘤特异性体细胞突变的抗原片段，从而制备个性化癌症疫苗的方法。
技术介绍
癌症的发生，是因为病人体内的某些细胞产生了基因突变，出现不受控制地增殖分化，最终发展成为恶性肿瘤。癌细胞表面存在许多由突变基因编码的新生抗原蛋白，正常情况下应能被人体免疫系统及时识别，并引发免疫反应将这些癌细胞清除。然而在病理情况下，肿瘤细胞发展分化迅速，且不断发生新的突变，使得机体免疫系统不能及时识别。再加上肿瘤微环境中形成的免疫抑制，可能使免疫系统完全丧失反应能力。虽然目前比较先进的免疫治疗疗法，如CAR-T技术等，能够在体外改造T细胞，增强其肿瘤细胞免疫识别和反应能力，并在体外放大后在回注到病人身上，但是注射后病人自身还是不能复制这些细胞。当然，输入体内的免疫细胞中一部分可能会长期潜伏下来，成为“记忆细胞”，这样将来可能“复苏”。但这些细胞经过了基因改造，长期潜伏在人体内会造成什么问题？短期内没有答案。同时，过度降低免疫应答门槛，可能会导致过度的免疫反应及各种炎症。而最先进的个性化CAR-T技术目前也只对个别癌症的部分病人有效，并且最近也有异体CAR-T药物造成患者死亡的事件发生。癌症的免疫治疗，需另辟蹊径。癌细胞表面存在的由突变基因编码的新生抗原蛋白，之所以无法引起免疫应答，可能是这些异常蛋白表达量不高，不足以引发机体免疫识别和免疫反应。而肿瘤基因组测序的开展，及癌症免疫治疗的进展，使得应用这些异常的肿瘤新生抗原蛋白来制作癌症疫苗成为可能(OttPANat2017；547:217-221,Epub2017Jul5；SahinUetal.Nat2017；547:222-226,Epub2017Jul5)。所谓个性化癌症疫苗，即根据患癌对象各自肿瘤细胞有关的突变情况定制设计的抗癌疫苗，是个性化医疗(精准医疗)发展的高级阶段。然而，如何高效地从组织中获取关键抗原，并安全地施用于所需要的对象从而有效地抑制肿瘤，至今仍面对着不少癌症疫苗挑战。例如疫苗制备时间较长，需6-8周；样本的获得必须进行手术切除晚期病人癌变组织，才能发现和证实肿瘤体细胞突变。癌症疫苗长周期和有创性的获得途径都难以满足患癌对象巨大的临床治疗需求。
技术实现思路
本专利技术的第一方面，提供了一种制备个性化癌症疫苗的方法，包括以下步骤：(a)提供对应于所述对象的第一样本测序数据集A1和第一对照测序数据集R1；和/或提供对应于所述对象的第二样本测序数据集A2和第二对照测序数据集R2，其中，所述的第一样本数据集A1和第一对照测序数据集R1通过包括以下步骤的方法获得：t1).提供第一样本，所述第一样本为含CTC细胞和正常体液细胞的样本；t2)对所述第一样本进行CTC细胞富集处理，从而获得经富集的第一样本，其中在所述的经富集的第一样本中，CTC细胞丰度C1≥5％并且正常体液细胞丰度C2≤95％，按所述经富集的样本中所有细胞的总数量计，并且CTC细胞丰度C1与正常体液细胞丰度C2之比记为B1(即B1＝C1/C2)；t3)从所述经富集的第一样本中抽提DNA和/或RNA，从而获得第一核酸样本，其中所述第一核酸样本包括来自CTC细胞的核酸样本以及来自正常体液细胞的核酸样本；和t4)对所述第一核酸样本进行测序，其中，将所述第一核酸样本中来自正常体液细胞的核酸样本作为来自CTC细胞的核酸样本的对照，从而获得第一样本测序数据集A1和第一对照测序数据集R1，其中第一样本测序数据集A1对应于CTC细胞的测序数据集，而第一对照测序数据集R1对应于正常体液细胞的测序数据集；其中，所述的第二样本数据集A2和第二对照测序数据集R2通过包括以下步骤的方法获得：w1).提供第二样本，所述第二样本为含循环肿瘤DNA(ctDNA)和循环肿瘤RNA(ctRNA)及其他游离DNA(cfDNA)和游离RNA(cfRNA)的样本；w2).对所述第二样本进行富集处理，从而获得经富集的第二核酸样本；其中，所述的经富集的第二核酸样本包括来自CTC细胞的ctDNA和ctRNA以及来自正常体液细胞的cfDNA和cfRNA，其中按所有核酸的总重量计算，ctDNA和ctRNA含量L1≥5％，而来自正常细胞cfDNA和cfRNA的含量L2≤95％，并且所述含量L1与L2之比记为B2(即B2＝L1/L2)；w3).对所述第二核酸样本进行测序，其中，将所述第二核酸样本中的样本中来自正常细胞的cfDNA和cfRNA作为来自CTC细胞的ctDNA和ctRNA的对照，从而获得第二样本测序数据集A2和第二对照测序数据集R2，其中第二样本测序数据集A2对应于CTC细胞的测序数据集，而第二对照测序数据集R2对应于正常体液细胞的测序数据集；(b).将所述第一样本测序数据集A1与第一对照测序数据集R1，或第二样本测序数据集A2与第二对照测序数据集R2，分别进行序列比对处理，从而获得第一候选数据集S1或第二候选数据集S2；其中，所述第一候选数据集S1中的任一序列元素是存在于所述A1但不存在于所述R1的元素；而所述第二候选数据集S2中的任一序列元素是存在于所述A2但不存在于所述R2的元素；(c).对于所述第一候选数据集S1和/或第二候选数据集S2中的任一序列元素，进行HLA类型I或II受体亲和力预测分析，从而获得一级选定的序列元素，所述一级选定的序列元素为与HLA类型I或II受体结合紧密(IC50≤500nm，较佳地，100nm)的序列元素；(d).基于所述一级选定的序列元素，合成对应于所述一级选定的(primarilyselected)序列元素的DNA、RNA、短肽链；(e).用所述合成的DNA、RNA、短肽链，进行离体T-细胞受体(TCR)结合试验和CD8+T细胞和/或CD4+T辅助细胞活化试验，从而获得10-30种二级选定的(secondarilyselected)序列元素，其中所述的二级选定的序列元素能够与TCR结合且使CD8+T细胞和/或CD4+T辅助细胞活化；(f).基于所述二级选定的序列元素，合成对应于所述二级选定的序列元素的DNA、RNA、肽链；(g).将上一步骤中合成的所述的DNA、RNA、肽链与药学上可接受的载体混合，从而制得药物组合物，即为个性化癌症疫苗。在另一优选例中，在经富集的第一样本中，CTC细胞丰度为5％至95％(较佳地10-90％)而正常体液细胞丰度为95％至5％(较佳地90-10％)，且CTC细胞丰度和正常体液细胞丰度相加之后为100％。在另一优选例中，在经富集的第二样本中，来自于CTC细胞的ctDNA和ctRNA含量为5％至95％(较佳地10-90％)而来自于正常细胞cfDNA和cfRNA的含量为95％至5％(较佳地90-10％)，且CTC细胞的ctDNA和ctRNA含量和正常细胞cfDNA和cfRNA含量相加之后为100％。在另一优选例中，所述第一核酸样本中，来自CTC细胞的核酸样本与来自正常体液细胞的核酸样本的重量比B2等于或基本上等于B1。在另一优选例中，第一对照测序数据集R1对应于正常的PBMC细胞的测序数据集。在另一优选例中，第二对照测序数据集R2对应于正常的PBMC细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制备个性化癌症疫苗的方法，其特征在于，包括以下步骤：(a)提供对应于所述对象的第一样本测序数据集A1和第一对照测序数据集R1；和/或提供对应于所述对象的第二样本测序数据集A2和第二对照测序数据集R2，其中，所述的第一样本数据集A1和第一对照测序数据集R1通过包括以下步骤的方法获得：t1).提供第一样本，所述第一样本为含CTC细胞和正常体液细胞的样本；t2)对所述第一样本进行CTC细胞富集处理，从而获得经富集的第一样本，其中在所述的经富集的第一样本中，CTC细胞丰度C1≥5％并且正常体液细胞丰度C2≤95％，按所述经富集的样本中所有细胞的总数量计，并且CTC细胞丰度C1与正常体液细胞丰度C2之比记为B1(即B1＝C1/C2)；t3)从所述经富集的第一样本中抽提DNA和/或RNA，从而获得第一核酸样本，其中所述第一核酸样本包括来自CTC细胞的核酸样本以及来自正常体液细胞的核酸样本；和t4)对所述第一核酸样本进行测序，其中，将所述第一核酸样本中来自正常体液细胞的核酸样本作为来自CTC细胞的核酸样本的对照，从而获得第一样本测序数据集A1和第一对照测序数据集R1，其中第一样本测序数据集A1对应于CTC细胞的测序数据集，而第一对照测序数据集R1对应于正常体液细胞的测序数据集；其中，所述的第二样本数据集A2和第二对照测序数据集R2通过包括以下步骤的方法获得：w1).提供第二样本，所述第二样本为含循环肿瘤DNA(ctDNA)和循环肿瘤RNA(ctRNA)及其他游离DNA(cfDNA)和游离RNA(cfRNA)的样本；w2).对所述第二样本进行富集处理，从而获得经富集的第二核酸样本；其中，所述的经富集的第二核酸样本包括来自CTC细胞的ctDNA和ctRNA以及来自正常体液细胞的cfDNA和cfRNA，其中按所有核酸的总重量计算，ctDNA和ctRNA含量L1≥5％，而来自正常细胞cfDNA和cfRNA的含量L2≤95％，并且所述含量L1与L2之比记为B2(即B2＝L1/L2)；w3).对所述第二核酸样本进行测序，其中，将所述第二核酸样本中的样本中来自正常细胞的cfDNA和cfRNA作为来自CTC细胞的ctDNA和ctRNA的对照，从而获得第二样本测序数据集A2和第二对照测序数据集R2，其中第二样本测序数据集A2对应于CTC细胞的测序数据集，而第二对照测序数据集R2对应于正常体液细胞的测序数据集；(b).将所述第一样本测序数据集A1与第一对照测序数据集R1，或第二样本测序数据集A2与第二对照测序数据集R2，分别进行序列比对处理，从而获得第一候选数据集S1或第二候选数据集S2；其中，所述第一候选数据集S1中的任一序列元素是存在于所述A1但不存在于所述R1的元素；而所述第二候选数据集S2中的任一序列元素是存在于所述A2但不存在于所述R2的元素；(c).对于所述第一候选数据集S1和/或第二候选数据集S2中的任一序列元素，进行HLA类型I或II受体亲和力预测分析，从而获得一级选定的序列元素，所述一级选定的序列元素为与HLA类型I或II受体结合紧密(IC50≤100nm)的序列元素；(d).基于所述一级选定的序列元素，合成对应于所述一级选定的(primarily selected)序列元素的DNA、RNA、短肽链；(e).用所述合成的DNA、RNA、短肽链，进行离体T‑细胞受体(TCR)结合试验和CD8+T细胞和/或CD4+T辅助细胞活化试验，从而获得10‑30种二级选定的(secondarily selected)序列元素，其中所述的二级选定的序列元素能够与TCR结合且使CD8+T细胞和/或CD4+T辅助细胞活化；(f).基于所述二级选定的序列元素，合成对应于所述二级选定的序列元素的DNA、RNA、肽链；(g).将上一步骤中合成的所述的DNA、RNA、肽链与药学上可接受的载体混合，从而制得药物组合物，即为个性化癌症疫苗。...

【技术特征摘要】
2017.12.01 CN 20171125247981.一种制备个性化癌症疫苗的方法，其特征在于，包括以下步骤：(a)提供对应于所述对象的第一样本测序数据集A1和第一对照测序数据集R1；和/或提供对应于所述对象的第二样本测序数据集A2和第二对照测序数据集R2，其中，所述的第一样本数据集A1和第一对照测序数据集R1通过包括以下步骤的方法获得：t1).提供第一样本，所述第一样本为含CTC细胞和正常体液细胞的样本；t2)对所述第一样本进行CTC细胞富集处理，从而获得经富集的第一样本，其中在所述的经富集的第一样本中，CTC细胞丰度C1≥5％并且正常体液细胞丰度C2≤95％，按所述经富集的样本中所有细胞的总数量计，并且CTC细胞丰度C1与正常体液细胞丰度C2之比记为B1(即B1＝C1/C2)；t3)从所述经富集的第一样本中抽提DNA和/或RNA，从而获得第一核酸样本，其中所述第一核酸样本包括来自CTC细胞的核酸样本以及来自正常体液细胞的核酸样本；和t4)对所述第一核酸样本进行测序，其中，将所述第一核酸样本中来自正常体液细胞的核酸样本作为来自CTC细胞的核酸样本的对照，从而获得第一样本测序数据集A1和第一对照测序数据集R1，其中第一样本测序数据集A1对应于CTC细胞的测序数据集，而第一对照测序数据集R1对应于正常体液细胞的测序数据集；其中，所述的第二样本数据集A2和第二对照测序数据集R2通过包括以下步骤的方法获得：w1).提供第二样本，所述第二样本为含循环肿瘤DNA(ctDNA)和循环肿瘤RNA(ctRNA)及其他游离DNA(cfDNA)和游离RNA(cfRNA)的样本；w2).对所述第二样本进行富集处理，从而获得经富集的第二核酸样本；其中，所述的经富集的第二核酸样本包括来自CTC细胞的ctDNA和ctRNA以及来自正常体液细胞的cfDNA和cfRNA，其中按所有核酸的总重量计算，ctDNA和ctRNA含量L1≥5％，而来自正常细胞cfDNA和cfRNA的含量L2≤95％，并且所述含量L1与L2之比记为B2(即B2＝L1/L2)；w3).对所述第二核酸样本进行测序，其中，将所述第二核酸样本中的样本中来自正常细胞的cfDNA和cfRNA作为来自CTC细胞的ctDNA和ctRNA的对照，从而获得第二样本测序数据集A2和第二对照测序数据集R2，其中第二样本测序数据集A2对应于CTC细胞的测序数据集，而第二对照测序数据集R2对应于正常体液细胞的测序数据集；(b).将所述第一样本测序数据集A1与第一对照测序数据集R1，或第二样本测序数据集A2与第二对照测序数据集R2，分别进行序列比对处理，从而获得第一候选数据集S1或第二候选数据集S2；其中，所述第一候选数据集S1中的任一序列元素是存在于所述A1但不存在于所述R1的元素；而所述第二候选数据集S2中的任一序列元素是存在于所述A2但不存在于所述R2的元素；(c).对于所述第一候选数据集S1和/或第二候选数据集S2中的任一序列元素，进行HLA类型I或II受体亲和力预测分析，从而获得一级选定的序列元素，所述一级选定的序列元素为与HLA类型I或II受体结合紧密(IC50≤100nm)的序列元素；(d).基于所述一级选定的序列元素，合成对应于所述一级选定的(primarilyselected)序列元素的DNA、RNA、短肽链；(e).用所述合成的DNA、RNA、短肽链，进行离体T-细胞受体(TCR)结合试验和CD8+T细胞和/或CD4+T辅助细胞活化试验，从而获得10-30种二级选定的(secondarilyselected)序列元素，其中所述的二级选定的序列元素能够与TCR结合且使CD8+T细胞和/或CD4+T辅助细胞活化；(f).基于所述二级选定的序列元素，合成对应于所述二级选定的序列元素的DNA、RNA、肽链；(g).将上一步骤中合成的所述的DNA、RNA、肽链与药学上可接受的载体混合，从而制得药物组合物，即为个性化癌症疫苗。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述分类和/或分析中，对于同一位点或位置的两类测序数据D1和D2，...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄跃进，杨盼，
申请(专利权)人：上海桀蒙生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31