筛选和分离肿瘤新生抗原的方法技术

本发明专利技术涉及筛选和分离肿瘤新生抗原的方法。具体地，本发明专利技术涉及建立多个能与癌症病人HLA I或II类(HLA agnostic)分子相结合并能激活癌症病人特异肿瘤浸润淋巴细胞TCR的肿瘤新生抗原展示(display)肽库或肿瘤新生抗原肽库，进行筛选，分离病人特异肿瘤新生抗原；并且，在3‑4周内，制备个体化癌症疫苗，从而开发快速、高效个体化实体肿瘤免疫治疗方案。本发明专利技术能在无创和不需要病人肿瘤组织或细胞的情况下，准确、快速、高效地捕获能够激发免疫反应的病人特异的肿瘤新生抗原并制成个体化癌症疫苗，在肿瘤、自身免疫疾病及感染性疾病治疗领域具有广泛的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
筛选和分离肿瘤新生抗原的方法
本专利技术属于生物医药
，具体地，涉及筛选和分离肿瘤新生抗原的方法。更具体地，本专利技术涉及能与癌症病人HLAI或II类(HLAagnostic)分子相结合并能激活癌症病人特异肿瘤浸润淋巴细胞TCR的肿瘤新生抗原展示(display)肽库或肿瘤新生抗原肽库的制备和筛选方法。
技术介绍
近年来，肿瘤的免疫治疗，主要包括免疫检验点抑制剂、过继细胞回输、肿瘤疫苗等，已成为抗肿瘤药物的新方向。目前，多种免疫疗法已被成功实现，并取得了良好的临床疗效，例如国外的抗PD-1和PD-L1单抗已被FDA批准上市，其中Opdivo和Keytruda已被CFDA批准在中国上市，以及两个在国外上市的CAR-T细胞治疗产品，诺华的Kymriah和凯特的Yescarta。所谓个体化癌症疫苗，即根据癌症病人肿瘤细胞特有的肿瘤新生抗原而定制的治疗性抗癌疫苗，是个体化精准医疗发展的高级阶段。肿瘤中的某些蛋白发生基因突变，这些异常蛋白是免疫系统识别癌细胞的关键，如果含有肿瘤新生抗原的疫苗注射于人体，免疫系统的T细胞就能找到带有这种蛋白抗原的癌细胞，加以消灭。《自然》杂志2017年7月在线发表了癌症研究领域取得的重要成果，两种个体化癌症疫苗在晚期黑色素瘤临床试验中表现安全、有效，这对开发快速、高效个体化癌症免疫治疗方案来说，具有里程碑式的重大意义。当然，其应用也面临挑战，例如许多肿瘤含有的肿瘤新生抗原较少；疫苗制备时间长，需6-12周；需有创切除晚期病人癌变组织，发现和证实肿瘤体细胞突变。尤其需要指出的是，基于生信学软件预测肿瘤新生抗原的准确性较低，从而造成个体化癌症疫苗治疗的有效性降低，难以满足癌症病人巨大的临床治疗需求。因此，本领域迫切需要开发能够提高个体化癌症疫苗免疫治疗的有效性的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的就是提供一种提高个体化癌症疫苗免疫治疗的有效性的方法。在本专利技术的第一方面，提供了一种分离和筛选肿瘤新生抗原的方法，所述方法包括以下步骤：(a)通过噬菌体展示(Phagedisplay)或其他展示技术，制备一个或多个能与癌症病人HLAI或II类分子结合的肿瘤新生抗原展示肽库；其中所述展示肽库具有以下一个或多个特征：(i)组成肽库的能与癌症病人HLAI类分子结合的多个多肽链长度为8-11个氨基酸残基，其中某些位点含相同或性质类似的氨基酸残基，而其他位点则含任意氨基酸残基，或更长或更短，但仍能与HLAI类分子有效结合；(ii)组成肽库的能与癌症病人HLAII类分子结合的多个多肽链长度可为10-25个氨基酸残基，更优选地13-18个氨基酸残基，其中某些位点含相同或性质类似的氨基酸残基，而其他位点则含任意氨基酸残基，或更长或更短，但仍能与HLAII类分子有效结合；(iii)多肽链在N端或C端含有添加的特异的表位编码序列标记，用于下游筛选；(iv)所制备的一个或多个能与癌症病人HLAI或II类分子结合的肿瘤新生抗原展示肽库，可来自于人工合成，和/或癌症病人肿瘤组织，和/或肿瘤细胞包括循环肿瘤细胞(CTC)，和/或肿瘤细胞系；(b)用分离自癌症病人免疫系统的带有磁珠或其他标记的CD4或CD8淋巴细胞或其他杀伤性T淋巴细胞，巨噬细胞，NK细胞等细胞，或加上带有磁珠或其他标记的事先用肽库多肽致敏过的(primed)来自该病人的树突状细胞(DC)或其他抗原提呈细胞(APC)，或加上肽库多肽直接与来自该病人的树突状细胞(DC)或其他抗原提呈细胞(APC)混合的混合物，对所制备的一个或多个能与癌症病人HLAI或II类分子结合的肿瘤新生抗原展示肽库，分别进行一轮或多轮筛选，从而分离出潜在的、能激活病人特异CD4或CD8淋巴细胞或其他杀伤性T淋巴细胞，巨噬细胞，NK细胞等的肿瘤新生抗原；或者，用从癌症病人外周血中分离的带有磁珠或其他标记的多种多克隆抗体，对所制备的一个或多个能与癌症病人HLAI或II类分子结合的肿瘤新生抗原展示肽库，分别进行一轮或多轮筛选，从而分离出潜在的、能特异结合某一种或多种抗体的肿瘤新生抗原；(c)对分离出的潜在的、病人特异的肿瘤新生抗原，进行免疫细胞-抗原验证实验或抗原-抗体结合验证实验，从而确认病人特异的肿瘤新生抗原成分。在另一优选例中，步骤(c)中，进行体外(exvivo)的病人特异CD4或CD8淋巴细胞或其他杀伤性T淋巴细胞，巨噬细胞，NK细胞等的验证实验，或抗原抗体结合体外验证实验，从而确认病人特异的肿瘤新生抗原成分。在另一优选例中，步骤(c)中，进行体内(invivo)激活病人特异CD4或CD8淋巴细胞或其他杀伤性T淋巴细胞，巨噬细胞，NK细胞等的验证实验，从而确认病人特异的肿瘤新生抗原成分。在另一优选例中，该肽库还可在经过PD-1或PD-L1抑制剂治疗病人或PD-1和/或PD-L1表达低下的病人中预警PD-1或PD-L1抑制剂治疗引起的自身免疫反应，从而辨别病人是否适于PD-1或PD-L1抑制剂免疫治疗，避免严重的心脏毒副作用。在另一优选例中，所述展示肽库具有特征(i)、(ii)、(iii)和(iv)；或具有(i)、(iii)和(iv)：或具有(ii)、(iii)和(iv)。在另一优选例中，所述的噬菌体展示或其他展示技术包括但不限于：噬菌体展示技术、酵母展示技术、mRNA展示技术、细胞展示技术等。在另一优选例中，所述制备的一个或多个能与癌症病人HLAI或II类分子结合的肿瘤新生抗原展示肽库，优选为1-100个肿瘤新生抗原展示肽库，更优选为1-50个，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15及20、30、40、50个肿瘤新生抗原展示肽库。在另一优选例中，对所制备的一个或多个能与癌症病人HLAI或II类分子结合的肿瘤新生抗原展示肽库，分别进行一轮或多轮筛选，优选为1-20轮筛选，更优选为1-10轮，1-5轮筛选，如1、2、3、4、5轮。在另一优选例中，其他抗原提呈细胞包括但不限于：单核/巨噬细胞，B淋巴细胞，内皮细胞，成纤维细胞，上皮及间质细胞，嗜酸性粒细胞等。在另一优选例中，所述方法包括以下步骤：(a)通过细菌表达或细胞表达技术，制备一个或多个能与癌症病人HLAI或II类分子结合的肿瘤新生抗原肽库；其中所述肽库具有以下一个或多个特征：(i)组成肽库的能与癌症病人HLAI类分子结合的多个多肽链长度可为8-11个氨基酸残基，其中某些位点含相同或性质类似的氨基酸残基，而其他位点则含任意氨基酸残基，或更长或更短，但仍能与HLAI类分子有效结合；(ii)组成肽库的能与癌症病人HLAII类分子结合的多个多肽链长度可为10-25个氨基酸残基，更优选地13-18个氨基酸残基，其中某些位点含相同或性质类似的氨基酸残基，而其他位点则含任意氨基酸残基，或更长或更短，但仍能与HLAII类分子有效结合；(iii)多肽链在N端或C端含有添加的特异的表位编码序列标记，用于下游筛选；(iv)所制备的一个或本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种分离和筛选肿瘤新生抗原的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：/n(a)通过噬菌体展示(Phage display)或其他展示技术，制备一个或多个能与癌症病人HLA I或II类分子结合的肿瘤新生抗原展示肽库；其中所述展示肽库具有以下一个或多个特征：/n(i)组成肽库的能与癌症病人HLA I类分子结合的多个多肽链长度为8-11个氨基酸残基，其中某些位点含相同或性质类似的氨基酸残基，而其他位点则含任意氨基酸残基，或更长或更短，但仍能与HLAI类分子有效结合；/n(ii)组成肽库的能与癌症病人HLA II类分子结合的多个多肽链长度可为10-25个氨基酸残基，更优选地13-18个氨基酸残基，其中某些位点含相同或性质类似的氨基酸残基，而其他位点则含任意氨基酸残基，或更长或更短，但仍能与HLAII类分子有效结合；/n(iii)多肽链在N端或C端含有添加的特异的表位编码序列标记，用于下游筛选；/n(iv)所制备的一个或多个能与癌症病人HLA I或II类分子结合的肿瘤新生抗原展示肽库，可来自于人工合成，和/或癌症病人肿瘤组织，和/或肿瘤细胞包括循环肿瘤细胞(CTC)，和/或肿瘤细胞系；/n(b)用分离自癌症病人免疫系统的带有磁珠或其他标记的CD4或CD8淋巴细胞或其他杀伤性T淋巴细胞，巨噬细胞，NK细胞等细胞，或加上带有磁珠或其他标记的事先用肽库多肽致敏过的(primed)来自该病人的树突状细胞(DC)或其他抗原提呈细胞(APC)，或加上肽库多肽直接与来自该病人的树突状细胞(DC)或其他抗原提呈细胞(APC)混合的混合物，对所制备的一个或多个能与癌症病人HLAI或II类分子结合的肿瘤新生抗原展示肽库，分别进行一轮或多轮筛选，从而分离出潜在的、能激活病人特异CD4或CD8淋巴细胞或其他杀伤性T淋巴细胞，巨噬细胞，NK细胞等的肿瘤新生抗原；/n或者，/n用从癌症病人外周血中分离的带有磁珠或其他标记的多种多克隆抗体，对所制备的一个或多个能与癌症病人HLA I或II类分子结合的肿瘤新生抗原展示肽库，分别进行一轮或多轮筛选，从而分离出潜在的、能特异结合某一种或多种抗体的肿瘤新生抗原；/n(c)对分离出的潜在的、病人特异的肿瘤新生抗原，进行免疫细胞-抗原验证实验或抗原-抗体结合验证实验，从而确认病人特异的肿瘤新生抗原成分。/n...

【技术特征摘要】
1.一种分离和筛选肿瘤新生抗原的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(a)通过噬菌体展示(Phagedisplay)或其他展示技术，制备一个或多个能与癌症病人HLAI或II类分子结合的肿瘤新生抗原展示肽库；其中所述展示肽库具有以下一个或多个特征：
(i)组成肽库的能与癌症病人HLAI类分子结合的多个多肽链长度为8-11个氨基酸残基，其中某些位点含相同或性质类似的氨基酸残基，而其他位点则含任意氨基酸残基，或更长或更短，但仍能与HLAI类分子有效结合；
(ii)组成肽库的能与癌症病人HLAII类分子结合的多个多肽链长度可为10-25个氨基酸残基，更优选地13-18个氨基酸残基，其中某些位点含相同或性质类似的氨基酸残基，而其他位点则含任意氨基酸残基，或更长或更短，但仍能与HLAII类分子有效结合；
(iii)多肽链在N端或C端含有添加的特异的表位编码序列标记，用于下游筛选；
(iv)所制备的一个或多个能与癌症病人HLAI或II类分子结合的肿瘤新生抗原展示肽库，可来自于人工合成，和/或癌症病人肿瘤组织，和/或肿瘤细胞包括循环肿瘤细胞(CTC)，和/或肿瘤细胞系；
(b)用分离自癌症病人免疫系统的带有磁珠或其他标记的CD4或CD8淋巴细胞或其他杀伤性T淋巴细胞，巨噬细胞，NK细胞等细胞，或加上带有磁珠或其他标记的事先用肽库多肽致敏过的(primed)来自该病人的树突状细胞(DC)或其他抗原提呈细胞(APC)，或加上肽库多肽直接与来自该病人的树突状细胞(DC)或其他抗原提呈细胞(APC)混合的混合物，对所制备的一个或多个能与癌症病人HLAI或II类分子结合的肿瘤新生抗原展示肽库，分别进行一轮或多轮筛选，从而分离出潜在的、能激活病人特异CD4或CD8淋巴细胞或其他杀伤性T淋巴细胞，巨噬细胞，NK细胞等的肿瘤新生抗原；
或者，
用从癌症病人外周血中分离的带有磁珠或其他标记的多种多克隆抗体，对所制备的一个或多个能与癌症病人HLAI或II类分子结合的肿瘤新生抗原展示肽库，分别进行一轮或多轮筛选，从而分离出潜在的、能特异结合某一种或多种抗体的肿瘤新生抗原；
(c)对分离出的潜在的、病人特异的肿瘤新生抗原，进行免疫细胞-抗原验证实验或抗原-抗体结合验证实验，从而确认病人特异的肿瘤新生抗原成分。


2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(a)通过细菌表达或细胞表达技术，制备一个或多个能与癌症病人HLAI或II类分子结合的肿瘤新生抗原肽库；其中所述肽库具有以下一个或多个特征：
(i)组成肽库的能与癌症病人HLAI类分子结合的多个多肽链长度可为8-11个氨基酸残基，其中某些位点含相同或性质类似的氨基酸残基，而其他位点则含任意氨基酸残基，或更长或更短，但仍能与HLAI类分子有效结合；
(ii)组成肽库的能与癌症病人HLAII类分子结合的多个多肽链长度可为10-25个氨基酸残基，更优选地13-18个氨基酸残基，其中某些位点含相同或性质类似的氨基酸残基，而其他位点则含任意氨基酸残基，或更长或更短，但仍能与HLAII类分子有效结合；
(iii)多肽链在N端或C端含有添加的特异的表位编码序列标记，用于下游筛选；
(iv)所制备的一个或多个能与癌症病人HLAI或II类分子结合的肿瘤新生抗原肽库，可来自于人工合成，和/或癌症病人肿瘤组织，和/或肿瘤细胞包括CTC，和/或肿瘤细胞系...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄跃进，焦顺昌，
申请(专利权)人：上海桀蒙生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31