病毒疫苗的制备方法及药物组合物技术

本发明专利技术提供了一种病毒疫苗的制备方法，包括提供至少一种病毒的全长或部分的抗原肽或蛋白的编码序列，将所述全长或部分的抗原肽或蛋白的编码区域分成一个或多个部分重叠核酸序列，再以串联形式连接成为核酸疫苗片段。本发明专利技术的所述病毒疫苗的制备方法所制备的核酸疫苗注射进入动物和人体后，经体内细胞处理形成小片段抗原肽疫苗，可有效避免全长蛋白疫苗可能引起的严重副作用，但又保持所述抗原肽或蛋白的免疫原性，从而能有效拮抗病毒感染。同时，小片段抗原肽成分可根据新冠病毒S蛋白发生突变而作快速相应调整，因此核酸疫苗对新冠病毒突变株也能有效。本发明专利技术还提供了经所述病毒疫苗的制备方法得到的药物组合物。

【技术实现步骤摘要】
病毒疫苗的制备方法及药物组合物
本专利技术涉及生物
，尤其涉及病毒疫苗的制备方法及药物组合物。
技术介绍
2020年1月10日，新型冠状病毒的第一个基因组序列数据公布。研究者将新型冠状病毒与已知明确感染人的两种冠状病毒，即重症急性呼吸综合征(SevereAcuteRespiratorySyndromes，SARS)冠状病毒以及中东呼吸综合征(MiddleEastRespiratorySyndromes，MERS)冠状病毒进行了全基因组比对，发现新型冠状病毒与SARS冠状病毒和MERS冠状病毒相比，分别有平均70％和40％的序列相似性，其中不同冠状病毒与宿主细胞作用的关键基因，即刺突蛋白(spikeprotein)编码基因具有更大的差异性。目前尚无针对新型冠状病毒的疫苗或特异性治疗方法，确诊为新型冠状病毒感染的患者仅根据个人症状和临床情况接受支持性治疗，病死率约1-4％。因此，迫切需要安全有效能拮抗新型冠状病毒感染的疫苗及其药物组合物。SARS是进入二十一世纪以来发现的第一种新的传染病，2003年4月发现其病原体是一种新型冠状病毒，命名为SARS冠状病毒。截止2003年9月，在五大洲29个国家，共确诊8098病例，774例死亡，病死率约10％。SARS冠状病毒刺突蛋白由两个亚单位组成，S1亚单位含有与宿主细胞受体-血管紧张素转换酶2(ACE2)相结合的受体结合域，共有666个氨基酸残基。而S2亚单位介导病毒与宿主细胞膜的融合，由583个氨基酸残基组成。在SARS冠状病毒感染时刺突蛋白在诱导中和抗体，T细胞免疫反应及提供保护性免疫方面起关键作用。MERS冠状病毒也是一种新发现的人畜共患病原体，从2012年沙特阿拉伯的一个致命的人类病例开始，在25个国家中有近1800人陆续受到感染。病人致死率约30-40％。但60％以上的病人能康复、清除病毒和发展免疫表明，MERS冠状病毒的刺突蛋白等成分可能是一种合适的候选疫苗。这进一步得到了动物实验的证明。在这些实验中，从病人血清分离的几种抗MERS冠状病毒刺突蛋白中和抗体能中和及阻止低浓度病毒进入细胞和传播，有时能提供有效保护。虽然这些实验性疫苗能诱导动物产生保护性反应，但与新型冠状病毒类似的SARS冠状病毒和MERS冠状病毒的疫苗研发进展表明，使用全长刺突蛋白和其他病毒蛋白作为候选疫苗可能存在严重的安全问题，包括免疫病理学和促进疾病发展，可能由于诱导了Th2-偏态免疫反应和/或抗刺突蛋白非中和抗体。因此有必要制备新型的病毒疫苗及药物组合物，以避免现有技术中存在的上述问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种病毒疫苗的制备方法，可有效避免全长蛋白疫苗可能引起的严重副作用，但又保持所述抗原肽或蛋白的免疫原性，从而能有效拮抗病毒感染。同时，小片段抗原肽成分可根据新冠病毒S蛋白发生突变而作快速相应调整，因此核酸疫苗对新冠病毒突变株也能有效。本专利技术还提供了经所述制备方法得到的病毒疫苗及其应用。本专利技术能准确、快速、高效地捕获能够激发人体或其他病毒宿主免疫反应的病毒抗原肽或蛋白并快速制备病毒核酸疫苗，在感染性疾病、肿瘤、自身免疫疾病领域具有广泛的应用前景。为实现上述目的，本专利技术的所述病毒疫苗的制备方法包括：S1：提供至少一种病毒的全长或部分抗原肽或蛋白的编码核酸序列；S2：将所述全长或部分抗原肽或蛋白的编码区域分成一个或多个由60-150个核苷酸组成的部分重叠核酸序列，以编码20-50个氨基酸残基，每个所述部分重叠核酸序列用弗林蛋白酶切位点编码序列或非免疫原性甘氨酸或丝氨酸连接子编码序列分离，使5-15个氨基酸残基编码序列重叠，再以串联形式将多个所述部分重叠核酸序列连接成为核酸疫苗片段；S3：从5’端至3’端方向依次或随机操作性连接连接元件，以形成核酸序列；S4：将所述核酸序列通过分子生物学方法经基因合成和亚克隆至常规质粒序列，在洁净环境下制备核酸疫苗。本专利技术的所述病毒疫苗的制备方法的有益效果在于：将所述全长或部分抗原肽或蛋白的编码区域分成至少一个所述部分重叠核酸序列，再以串联形式将多个所述部分重叠核酸序列连接成为核酸疫苗片段，可有效避免全长蛋白疫苗可能引起的严重副作用，但又保持所述抗原肽或蛋白的免疫原性，从而能有效拮抗病毒感染。同时，小片段抗原肽成分可根据新冠病毒S蛋白发生突变而作快速相应调整，因此核酸疫苗对新冠病毒突变株也能有效。优选的，所述连接元件包括5’端的非翻译片段、Kozak序列、起始密码子序列、所述核酸疫苗片段、终止密码子序列、Poly(A)信号序列和3’端的非翻译片段，所述步骤S3中，从5’端至3’端方向依次或随机操作性连接所述5’端的非翻译片段、所述Kozak序列、所述起始密码子序列、所述核酸疫苗片段、所述终止密码子序列、所述Poly(A)信号序列和所述3’端的非翻译片段，以通过所述步骤S4制备DNA疫苗。进一步优选的，在所述起始密码子序列和所述核酸疫苗片段之间连接MHCI类分子的信号肽和转运区域编码序列。优选的，所述连接元件包括5’帽结构、5’端的非翻译片段、Kozak序列、起始密码子序列、所述核酸疫苗片段、终止密码子序列、3’端的非翻译片段和Poly(A)序列，所述步骤S3中，从5’端至3’端方向依次或随机操作性连接所述5’帽结构、所述5’端的非翻译片段、所述kozak序列、所述起始密码子序列、所述核酸疫苗片段、所述终止密码子序列、所述3’端的非翻译片段和所述Poly(A)序列，以通过所述步骤S4并经体外转录制备mRNA疫苗。进一步优选的，在所述起始密码子序列和所述核酸疫苗片段之间连接MHCI类分子的信号肽和转运区域编码序列。优选的，所述Poly(A)序列包含20-400个腺嘌呤核苷酸。进一步优选的，所述Poly(A)序列包含60-250个腺嘌呤核苷酸。优选的，所述部分重叠核酸序列来源于人工修饰后的核酸，以增强所述核酸序列的稳定性。进一步优选的，所述核酸序列的编码区域的密码子适应指数为0.5-1，以适合人密码子使用。优选的，所述病毒的抗原肽或蛋白包含刺突蛋白、所述刺突蛋白的S1亚单位和S2亚单位、病毒结构蛋白，或所述刺突蛋白、所述刺突蛋白的S1亚单位和S2亚单位、以及所述病毒结构蛋白中任意一种或多种的片段、变体或衍生物，所述刺突蛋白的S1亚单位包括受体结合域，所述病毒结构蛋白包括血凝素、神经氨酸酶、包膜蛋白、膜蛋白和核衣壳蛋白中的任意一种或多种。进一步优选的，所述病毒抗原肽或蛋白包含所述刺突蛋白，或所述刺突蛋白的片段、变体或衍生物中的任意一种或多种。进一步优选的，所述病毒抗原肽或蛋白包含所述刺突蛋白的S1亚单位和S2亚单位，或其变体或衍生物中的任意一种或多种。其有益效果在于能识别宿主细胞受体，提供特异抗原。进一步优选的，所述抗原肽或蛋白还包含所述血凝素、神经氨酸酶、包膜蛋白、膜蛋白或核衣壳蛋白，或这些病毒结构蛋白的片段、变体或衍生物中的任意一种或多种，所述血凝素为HA蛋白，所述神经氨酸酶为NA蛋白。其有益效本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种病毒疫苗的制备方法，其特征在于，包括：/nS1：提供至少一种病毒的全长或部分抗原肽或蛋白的编码核酸序列；/nS2：将所述全长或部分抗原肽或蛋白的编码区域分成一个或多个由60-150个核苷酸组成的部分重叠核酸序列，以编码20-50个氨基酸残基，每个所述部分重叠核酸序列用弗林蛋白酶切位点编码序列或非免疫原性甘氨酸或丝氨酸连接子编码序列分离，使5-15个氨基酸残基编码序列重叠，再以串联形式将多个所述部分重叠核酸序列连接成为核酸疫苗片段；/nS3：从5’端至3’端方向依次或随机操作性连接连接元件，以形成核酸序列；/nS4：将所述核酸序列通过分子生物学方法经基因合成和亚克隆至常规质粒，在洁净环境下制备核酸疫苗。/n

【技术特征摘要】
20200131 CN 20201007780511.一种病毒疫苗的制备方法，其特征在于，包括：
S1：提供至少一种病毒的全长或部分抗原肽或蛋白的编码核酸序列；
S2：将所述全长或部分抗原肽或蛋白的编码区域分成一个或多个由60-150个核苷酸组成的部分重叠核酸序列，以编码20-50个氨基酸残基，每个所述部分重叠核酸序列用弗林蛋白酶切位点编码序列或非免疫原性甘氨酸或丝氨酸连接子编码序列分离，使5-15个氨基酸残基编码序列重叠，再以串联形式将多个所述部分重叠核酸序列连接成为核酸疫苗片段；
S3：从5’端至3’端方向依次或随机操作性连接连接元件，以形成核酸序列；
S4：将所述核酸序列通过分子生物学方法经基因合成和亚克隆至常规质粒，在洁净环境下制备核酸疫苗。


2.根据权利要求1所述的病毒疫苗的制备方法，其特征在于，所述连接元件包括5’端的非翻译片段、Kozak序列、起始密码子序列、所述核酸疫苗片段、终止密码子序列、Poly(A)信号序列和3’端的非翻译片段，所述步骤S3中，从5’端至3’端方向依次或随机操作性连接所述5’端的非翻译片段、所述Kozak序列、所述起始密码子序列、所述核酸疫苗片段、所述终止密码子序列、所述Poly(A)信号序列和所述3’端的非翻译片段，以通过所述步骤S4制备DNA疫苗。


3.根据权利要求1所述的病毒疫苗的制备方法，其特征在于，所述连接元件包括5’帽结构、5’端的非翻译片段、Kozak序列、起始密码子序列、所述核酸疫苗片段、终止密码子序列、3’端的非翻译片段和Poly(A)序列，所述步骤S3中，从5’端至3’端方向依次或随机操作性连接所述5’帽结构、所述5’端的非翻译片段、所述Kozak序列、所述起始密码子序列、所述核酸疫苗片段、所述终止密码子序列、所述3’端的非翻译片段和所述Poly(A)序列，以通过所述步骤S4并经体外转录制备mRNA疫苗。


4.根据权利要求1所述的病毒疫苗的制备方法，其特征在于，所述部分重叠核酸序列来源于人工修饰后的核酸，以增强所述核酸序列的稳定性。


5....

【专利技术属性】
技术研发人员：黄跃进，
申请(专利权)人：上海桀蒙生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31