含有MC1R基因的重组腺相关病毒的应用制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体涉及MC1R基因的重组腺相关病毒的应用，更具体的，涉及含有MC1R基因的重组腺相关病毒在制备改善记忆的药物中的应用，所述MC1R基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，本发明专利技术构建的腺相关病毒是目前所有的唯一一个可以特异性在兴奋性神经元中表达MC1R的病毒。注射该病毒的小鼠能够增强长期记忆，该结果表明，本发明专利技术的重组腺相关病毒有望用于开发与长期记忆损伤相关的疾病的药物。

【技术实现步骤摘要】
含有MC1R基因的重组腺相关病毒的应用
本专利技术涉及生物
，具体涉及含有MC1R基因的重组腺相关病毒的应用。
技术介绍
黑素皮质素1受体(MC1R)是一种环腺苷单磷酸刺激g蛋白偶联受体(GPCR)，通过黑色素合成途径调节皮肤生理。人类MC1R的功能缺失变异与红发、白皮肤和增加患黑素瘤的风险有关。在小鼠中，MC1R失活突变具有类似于人类红发/白皮肤的表型，导致皮肤保护受损，增强黑色素瘤的形成。此外，MC1R失活突变小鼠的皮肤出现了更严重的氧化损伤，表明MC1R和氧化应激介导的致癌机制有相关性。除了皮肤黑色素细胞，其他表达MC1R的组织和细胞类型包括肾上腺组织、免疫细胞、内皮细胞、1还有人星形细胞和神经元，这表明MC1R的功能可能不仅限于调节皮肤状态、毛发颜色、黑色素瘤，还有可能在神经系统中发挥重要的作用，目前的研究发现MC1R基因的改变还和帕金森病相关，这提示MC1R在神经系统疾病中可能有潜在治疗效果，但是MC1R在神经系统中的功能还不清楚。为了进一步研究MC1R在神经系统中的功能，本专利技术构建了能够在兴奋性神经元中特异性表达MC1R的腺相关病毒，该病毒可以增加MC1R基因在兴奋性神经元中的表达量，便于进一步研究MC1R在神经系统中的功能以及治疗神经系统中缺乏MC1R造成的病理损伤。
技术实现思路
有鉴于上述技术问题，本专利技术的目的之一是提供含有MC1R基因的重组腺相关病毒在制备改善记忆的药物中的应用，所述MC1R基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。进一步的，所述重组腺相关病毒的构建及包装，包括如下步骤：S1、提取小鼠总RNA，反转录成cDNA；S2、设计扩增引物，以S1的cDNA进行PCR扩增，获得目的基因MC1R；S3、将目的基因插入AAV载体pAAV-CaMKIIα-eGFP的EcoRI和HindIII酶切位点之间，得连接产物；S4、将所述连接产物转化至H5α感受态，培养，经阳性克隆鉴定，测序正确的为插入目的基因的rAAV重组腺相关病毒载体pAAV-CaMKIIα-eGFP-MC1R；S5、将质粒pAAV-DJ/8，pHelper及pAAV-CaMKIIα-eGFP-MC1R共转染至HEK293T细胞，转染后更换为完全培养基，然后收集富含AAV病毒颗粒的HEK-293细胞，纯化病毒，纯化产物即为能够特异性在兴奋性神经元中特异性表达MC1R基因的重组腺相关病毒。进一步的，扩增引物具体为：上游引物如SEQIDNO.2所示，下游引物如SEQIDNO.3所示。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：1、本专利技术构建的腺相关病毒是目前所有的唯一一个可以特异性在兴奋性神经元中表达MC1R的病毒。2、本专利技术构建的腺相关病毒可以在小鼠脑部的特定神经元(兴奋性神经元)中表达黑素皮质素1受体基因MC1R，小鼠海马区的兴奋性神经元中高表达MC1R基因后对小鼠的长期记忆会造成影响，具体为该病毒在小鼠海马齿状回中表达可以提升长期记忆，有望用于开发与长期记忆损伤相关的疾病的药物，如阿尔兹海默症。附图说明图1为实施例1构建好的pAAV-CaMKIIα-eGFP-MC1R质粒图谱。图2为rAAV-CaMKIIα-eGFP-MC1R包装过程中HEK-293细胞的变化。图3为重组腺相关病毒在小鼠脑中的表达情况。图4为小鼠海马齿状回区域立体定位注射该专利技术病毒后对长期记忆的影响情况。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本专利技术进行详细说明，但不应理解为本专利技术的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1含有MC1R基因的重组腺相关病毒载体的构建1.目的基因的获取取8周龄的小鼠，戊巴比妥钠麻醉后，用冰上预冷的PBS灌注后取脑，小鼠的全脑按左右切成两半，取半脑用trizol提取总RNA，检测RNA的浓度，使用1ug的RNA样品来逆转录合成cDNA。通过PCR扩增，得到目的基因，之后用PCR产物纯化试剂盒(购自生工生物)进行PCR产物纯化，得到目的基因。PCR所用的引物序列为：上游引物5’-GAATTCATGTCCACTCAGGAGCCCCAGAAGAGTC-3’，SEQIDNO.2所示；下游引物5’-AAGCTTTCACCAGGAGCACAGCAGCACCTCC-3’，SEQIDNO.3所示。2、构建重组腺相关病毒载体pAAV-CaMKIIα-eGFP-MC1R(图1)1)分别将PCR得到的目的基因和AAV载体pAAV-CaMKIIα-eGFP(addgene#50469)用EcoRI和HindIII酶切，切胶回收。2)使用T4DNA连接酶将酶切后切胶回收的目的基因片段与载体片段进行连接反应3)连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态，细菌涂于60mg/Lampr+LB固体培养基平板上，37℃倒置培养12-16h，挑取LB培养基上边缘光滑中等大小的单个菌落，接种于Ampr+LB液体培养基上，37℃摇床250rpm过夜。4)阳性克隆的鉴定，培养过夜的菌液使用目的基因获取时的PCR引物进行PCR扩增，然后琼脂糖凝胶电泳，条带大小为950左右的为备选克隆，挑取2～3个到华大基因进行测序，进一步验证克隆准确。测序正确的为插入目的基因的AAV载体pAAV-CaMKIIα-eGFP-MC1R。3.重组腺相关病毒rAAV-CaMKIIα-eGFP-MC1R的包装1)将质粒pAAV-DJ/8，pHelper(购自cellbiolabs)，及构建载体pAAV-CaMKIIα-eGFP-MC1R分别转入Stbl3感受态(购买自深圳康体生命公司)。三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提。抽提完成后质粒质量检测，质粒电泳只有一条带，并且浓度检测大于500ng/ul的质粒，方可用于病毒包装。2)病毒质粒pAAV-DJ/8，pHelper，及构建载体pAAV-CaMKIIα-eGFP-MC1R转染HEK293T细胞，转染后12h更换为完全培养基，72h后，rAAV-CaMKIIα-eGFP-MC1R包装过程中细胞的变化如图2所示，收集富含AAV病毒颗粒的HEK-293细胞，利用biomiga病毒纯化试剂盒进行病毒纯化。4.重组腺相关病毒rAAV-CaMKIIα-eGFP-MC1R的质量检测1)病毒滴度检测，采用荧光定量PCR(qPCR)的方法检测所得病毒溶液中包含目的片段的拷贝数，进而推知单位体积内有效病毒颗粒数，得出滴度，经过检测病毒的滴度约为6.19×1012。2)将病毒立体定位到小鼠海马中，14天后检测病毒在小鼠中的表达情况，结果如图3所示。实施例2本病毒在小鼠海马齿状回中表达对长期记忆的影响S1、小鼠进行条件性恐惧实验；本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.含有MC1R基因的重组腺相关病毒在制备改善记忆的药物中的应用，其特征在于，所述MC1R基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.含有MC1R基因的重组腺相关病毒在制备改善记忆的药物中的应用，其特征在于，所述MC1R基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。


2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述重组腺相关病毒的构建及包装，包括如下步骤：
S1、提取小鼠总RNA，反转录成cDNA；
S2、设计扩增引物，以S1的cDNA进行PCR扩增，获得目的基因MC1R；
S3、将目的基因插入AAV载体pAAV-CaMKIIα-eGFP的EcoRI和HindIII酶切位点之间，得连接产物；
S4、将所述连接产物转化至H5α感受态，培养，...

【专利技术属性】
技术研发人员：龚志婷，王晓兵，陈漫，刘秋碟，段延勤，段睿，李云，
申请(专利权)人：大理大学，
类型：发明
国别省市：云南;53