细胞培养基制造技术

本发明专利技术提供了具有新型氨基酸比率和/或胆酸亚铁作为铁载体的基础细胞培养基和补料培养基，其导致哺乳动物细胞培养工艺如CHO培养和蛋白质生产工艺的改善性能，特别是增加的产物滴度(例如单克隆抗体的)。还提供的是使用所述基础细胞培养基和任选的补料培养基，用于培养哺乳动物细胞并产生目的蛋白质的方法。本发明专利技术还提供了包含(i)基础细胞培养基和(ii)补料培养基的培养基平台。培养基的培养基平台。

【技术实现步骤摘要】
细胞培养基
[0001]本申请为申请日为2016年3月31日、申请号为201680020374.7、专利技术名称为“细胞培养基”的专利技术专利申请的分案申请。


[0002]本专利技术涉及哺乳动物细胞中的细胞培养和重组蛋白质生产领域。它具体涉及使用重组哺乳动物宿主细胞，在哺乳动物细胞培养中关于产物(例如(多)肽、抗体、抗体片段和抗体衍生分子)的最佳生产(例如滴度)和性能(例如细胞生长)的新型基础细胞培养基和新型补料培养基。

技术介绍

[0003]治疗性蛋白质(例如单克隆抗体)的大规模工业制造的哺乳动物细胞培养工艺的开发在约25年前开始。用于生产生物制药的有效生物工艺主要需要(i)高产、稳定和法规接受的(通常为哺乳动物的)细胞系，(ii)最佳细胞培养基，以支持在不同(通常为哺乳动物的)宿主细胞以及不同的培养系统和工艺模式(例如在不同的规模下以及作为例如分批、补料分批和灌注工艺)中的细胞生长和生产，和(iii)最佳的技术生物工艺，其特征在于例如通过搅拌器和气体供应的适当配置的氧气最佳供应，所有相关工艺参数的自动控制，以确保一致的产物质量，或可以从小规模工艺开发(mL至L规模)到大规模制造(>2.000L)扩大的工艺设计，而不妥协性能和产物质量。
[0004]在该上下文中，细胞培养基具有关键作用，并且与其天然来源相比，必须满足在技术系统中悬浮培养的哺乳动物细胞的复杂营养需求。例如，用于生物制药生产的最广泛使用的细胞系最初衍生自中国仓鼠卵巢(CHO细胞)。
[0005]在过去，血清被用作培养基添加剂，以提供通常不存在于细胞培养基中的营养素或载体蛋白质，例如胆固醇和转铁蛋白或细胞
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底物附着因子(例如纤连蛋白)、其他激素和生长因子，以及保护细胞培养基内的某些必需营养素和结合有毒组分。然而，在用于生产治疗剂的细胞培养基中，血清可以潜在地引入动物病毒，并且由于不确定的原材料来源，它可以将其他不期望的污染物(例如抗生素或蛋白酶)引入细胞培养过程内。这些化合物被成功替代，并且无血清细胞培养基已成为工业实践用于工艺开发和生物制药的重组生产。例如，CHO(中国仓鼠卵巢)细胞在含有人胰岛素作为唯一的培养基蛋白质组分的无血清培养基中连续繁殖(Keen和Rapson，Cytotechnology,Oct 17(3):153
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63,1995)。
[0006]通常用于生物制药生产的另一组培养基组分是衍生自动物来源或衍生自植物的水解产物。由于相关的安全风险，只要有可能，从该过程中去除来自动物来源的水解产物。水解产物通常含有氨基酸、小肽、无机离子、微量元素、碳水化合物和维生素的混合物，并且广泛用于用各种(必需)营养素富集培养基，以增加总体生长和生产率。除安全方面之外，另一个缺点是水解产物并非化学成分确定的事实，因此批次之间的精确组成可以改变(批次间变化性)，并且出于该原因，对工艺重现性具有负面影响。因为水解产物含有许多化合物且具有复杂(每一个细节未知)组成，它们不能容易地被替代，而不影响细胞培养性能(例如
产物产率)。筛选并随后用化学成分确定的组分替代这种不确定的原材料，同时维持一致的产物质量和高产物滴度是生物工艺开发的持久和未解决的挑战。不仅需要确定确切的化学组成，还需要确定每一种组分的确切浓度。由于安全方面，如今主要使用来自植物来源的水解产物(例如大豆水解产物)。然而，不确定的组成问题依然存在。
[0007]目前生物制药工艺开发旨在化学成分确定的培养基(无血清、无动物组分、化学成分确定的)。这导致进一步降低污染物的风险(例如降低衍生自未知营养素来源的有机材料、内毒素、未知金属和微量元素)，并且还促进对关于一致原材料的上游和下游加工的所有方面的控制增加，而没有与安全和批次间变化性相关的任何风险。仅最近，“化学成分确定的”(注意仍不存在明确定义这一术语的行业标准)培养基变得商业上可用于哺乳动物细胞培养，但在工业制造中的应用目前仍是有限的。
[0008]这种“化学成分确定的”水解产物或培养基补充物的确切组成是已知的(但通常仅对于培养基供应商)，以便不使用不确定的原材料。这些化学成分确定的培养基仍是复杂的，并且含有高达约40
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50种“关键组分”。但它们由不同的构件块组成。为了设计这种复杂的“化学成分确定的”培养基，有必要尽可能地模拟植物或动物衍生的水解产物，这需要这些水解产物的广泛分级，随后为高端分析。这一领域的主要挑战通过细胞培养基中存在的化合物的巨大差异给出。
[0009]高性能细胞培养基的最佳设计由于许多工艺以所谓的补料分批模式执行而进一步复杂化，即将细胞培养物在基础开始培养基中接种，然后(通常在约0至3天之后)，当培养基底物由于细胞生长而耗尽时，供应浓缩补料培养基以维持生长和生产。从开始就提供所有的培养基化合物(分批模式)导致亚最佳工艺性能，因为那样细胞在开始时过量补料(例如导致不需要的副产物乳酸盐的高度形成，这转而又对细胞生长和存活率具有不利作用)。在该上下文中的主要挑战是设计最佳的分批培养基(基础细胞培养基)和最佳的补料分批培养基(补料培养基)，所述培养基在培养运行时间自始至终完全匹配细胞培养过程中的最佳生长和生产。因为活细胞浓度、细胞培养物的存活率和细胞培养过程的营养需求随著培养工艺的时间进程(在每小时至每日的基础上)显著改变，所以最佳分批和补料分批培养基(基础细胞培养基和补料培养基)的设计是艰巨的任务。由于通常设计一种补料培养基为总共持续约2
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3周的发酵工艺中每一个小时和每一天提供最佳解决方案，这甚至是更加困难的。
[0010]使用“合理的”方法的工业哺乳动物细胞培养基设计中的技术水平已通过Fletcher进行概括(Fletcher T.,BioProcess International 3(1),30
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36,2005)，并且这种方法仍可以视为工业实践中的合理的培养基设计的技术水平概念。应指出合理的培养基设计的复杂性不仅通过涉及许多组分的事实给出，还通过需要考虑的培养基化合物的特定浓度和复杂的相互作用给出。
[0011]根据Fletcher，培养基设计中存在三种基本方法。这些是i)(单一)组分滴定(例如在滴度上定义剂量应答的实验)，ii)培养基共混(简单地共混现有(复合)培养基并鉴定最佳共混物)，iii)废培养基分析(通过废培养基相对于新鲜培养基的化学分析描述营养素耗尽；注意在此方法中不考虑在细胞基础上的特定代谢需求)，iv)自动化筛选(机器人流体处理，其中重点关注例如多孔板中的流通量)。根据Fletcher，这些方法无一在各方面都是最佳的，而且每种方法具有其自己的特殊弱点。例如，i)组分滴定促使大量样品被分析，这在
工业实践中由于许多原因(例如容量、成本、资源)是不可行的，ii)培养基共混导致改善的流通量，但这种方法是弱指导性的并且在范围方面非常有限，iii)废培养基分析可以提供培养基化学如何随时间变化的重要信息，但基于通常的废培养基分析仅集中于相当有限数目的组分的事实(注意，例如，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于培养哺乳动物细胞的基础细胞培养基和补料细胞培养基的组合，其中所述基础细胞培养基包含相对于异亮氨酸的下述摩尔比(mM/mM)的下述氨基酸：约1.2
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2.2的L
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亮氨酸/L
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异亮氨酸，约0.5
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0.9的L
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苯丙氨酸/L
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异亮氨酸，约1.5
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2.7的L
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酪氨酸/L
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异亮氨酸，约1.0
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1.9的L
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苏氨酸/1
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异亮氨酸，和约1.0
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1.9的L
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缬氨酸/L
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异亮氨酸，其中所述基础细胞培养基具有约25至150mM的总氨基酸含量，其中所述补料细胞培养基包含相对于异亮氨酸的下述摩尔比(mM/mM)的下述氨基酸：约2.3
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4.2的L
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亮氨酸/L
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异亮氨酸，约0.6
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1.1的L
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苯丙氨酸/L
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异亮氨酸，约1.3
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2.4的L
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苏氨酸/1
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异亮氨酸，和约1.1
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2.0的L
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缬氨酸/L
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异亮氨酸，其中所述补料培养基具有约100至1000mM的总氨基酸含量。2.权利要求1的组合，其中所述基础细胞培养基进一步包含相对于异亮氨酸约1.6
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2.9的摩尔比(mM/mM)的L
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赖氨酸。3.权利要求1或2的组合，其中所述基础细胞培养基进一步包含相对于异亮氨酸的下述摩尔比(mM/mM)的下述氨基酸中的至少一种：约0.3
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0.5的L
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色氨酸/L
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异亮氨酸，约1.6
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3.0的L
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脯氨酸/L
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异亮氨酸；或约0.4
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0.7的L
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甲硫氨酸/L
...

【专利技术属性】
技术研发人员：C，
申请(专利权)人：勃林格殷格翰国际公司，
类型：发明
国别省市：