使用水性双相系统用于纯化且富集蛋白质技术方案

本发明专利技术涉及用于纯化且富集选自以下的靶产物的方法：

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用水性双相系统用于纯化且富集蛋白质、核酸或病毒的方法


[0001]本专利技术涉及使用水性双相系统用于纯化且富集免疫球蛋白或其它蛋白质；或质粒
DNA、
基因组
DNA、RNA
或其它核酸；或病毒的方法
。

技术介绍

[0002]生物分子，例如蛋白质，在各种应用中具有越来越大的重要性，例如作为药物
、
诊断学
、
食品中的添加剂
、
洗涤剂
、
研究试剂等等
。
从天然资源中提取是不够的，因此使用了生物技术生产方法
。
这需要所获得的蛋白质的常规再加工和纯化
。
[0003]对于生物制药中使用的蛋白质，例如治疗性抗体，不仅产物产率，而且杂质的分离都是重要的
。
存在工艺依赖性杂质，例如宿主细胞
、
宿主细胞的组分，例如蛋白质
(
宿主细胞蛋白，
HCP)
以及起因于细胞培养物本身或再加工的核酸，例如盐或脱离的层析配体
。
另外，可能存在产物依赖性杂质，例如具有偏离特性的产物的分子变体，例如截短形式
、
前体
、
水解降解产物或修饰形式，例如聚合物和聚集体
。
其它杂质包括污染物，即，以不希望有的方式存在于细胞培养物中的化学
、
生物化学或微生物性质的材料
。
[0004]生物制药中的杂质是无法接受的，因为它们可以引起不希望有的副作用，例如过敏反应或不良免疫反应，其甚至可以导致危及生命的过敏性休克
。
因此，需要可以将不希望有的杂质减少到无害的最低限度的合适的清洁方法
。
[0005]如现有技术中当前所述的，单克隆抗体生产基于所谓的批处理平台方法
[1,2]。
此类方法分为上游加工和下游加工
。
重组靶蛋白的生产基于在上游加工过程中在生物反应器中的细胞培养
。
后续下游加工的目标是使用各种单元操作例如离心
、
过滤和层析，将靶蛋白与辅助组分例如宿主细胞蛋白
(HCP)、
宿主细胞
DNA、
培养基组分
、
病毒和内毒素分离
。
[0006]此类平台工艺包括哺乳动物细胞在体积高达
20,000L
的生物反应器中的补料分批悬浮培养，作为细胞收获的离心和深度过滤，作为捕获的蛋白
A
亲和层析
(
分离步骤
)
，作为中间纯化的阳离子交换层析
(CIEX)
和作为精细纯化步骤的疏水作用层析
(HIC)。
另外，正交病毒灭活步骤用低
pH
和病毒过滤进行，以使免疫原性降到最低
。
在蛋白
A
亲和层析之后，并且由于用于病毒灭活的低
pH
，必须进行渗滤以便加载下述
CIEX。
[0007]然而，关于已建立的平台工艺，由于通过上游工艺优化
(
即，细胞改造
、
培养基和工艺参数优化
)
增加的产物浓度，层析步骤正在达到其容量极限
。
这种约束通常称为下游瓶颈
。
随着产物浓度增加，上游加工和下游加工的具体成本
(€/kg)
降低
。
然而，伴随更高的产物浓度，平台依赖性工艺达到其最佳效率
。
产物浓度的甚至更大增加导致商品成本
(COG)
从上游加工显著转变到下游加工
。
[0008]像这样，需要可以以简单的方式并尽可能经济地进行的合适的清洁方法
。
[0009]质粒
DNA(pDNA)
生产的当前状态也基于批处理平台工艺
。
在发酵过程中，
pDNA
在大肠杆菌系统中细胞内产生
。
通常，进行发酵溶液的离心用于收获
。
以这种方式获得的湿细胞糊
(WCP)
最初在裂解法中重悬浮，然后用碱性溶液消化，并且通过加入乙酸钾缓冲系统中
和
。
在中和步骤中，在使用的十二烷基硫酸钠
(SDS)
的帮助下，发生蛋白质及其它次要组分的絮凝
。
将中和的材料收集在收集容器中
。
在其中，所得到的絮凝物通过浮选被部分分离，并且在仪器的底部，溶液通过几个固定床层撤出并粗略澄清
。
再加工中的其它步骤包括渗滤
、
通过超滤浓缩
、
通过硫酸铵或其它盐沉淀以及两个或更多个层析步骤
[3]。
在当前的方法中，下游瓶颈是中和材料的收集器皿
。
在增加流通量和
/
或按比例扩大的情况下，由于高生物质负荷和在所产生的高体积下的同时絮凝，中和材料的分离和澄清是困难的
。
[0010]像这样，在这种情况下也需要合适的清洁方法
。
如上所述，由于
pDNA
的稳定性在此类初始加工步骤过程中仍然很低，因此将需要稳固
、
及时和简单的
pDNA
分离，以及使
pDNA
稳定的改善的杂质分离
。
[0011]源自宿主细胞本身并且在发酵或碱性消化过程中释放的工艺依赖性杂质，例如宿主细胞
、
宿主细胞组分例如蛋白质
(
宿主细胞蛋白，
HCP)、
核酸例如
RNA
和基因组
DNA、
内毒素
、
膜碎片等等，也在
pDNA
生产过程中产生
。
再加工导致例如盐或脱离的层析配体或再加工所需的添加物质，例如十二烷基硫酸钠
(SDS)。
另外，可能存在具有不同特性的产物依赖性杂质，例如
pDNA
的同种型
、
拓扑异构体和寡聚物
。
其它杂质包括污染物，即以不希望有的方式存在于发酵液中的化学
、
生物化学或微生物性质的材料
。
此外，如同先前的工艺，用于基因和细胞治疗的病毒生产分成上游工艺和下游工艺
。
上游方法涉及负责生产的细胞培养和为此目的所需的转染
。
当今生产的大多数病毒可以分类为腺病毒
(
平均大小
90nm
，无包膜
)
，腺伴随病毒
(
平均大小
20nm
，无包膜
)
，以及逆转录病毒和慢病毒
(
平均大小
90
‑
120nm
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.
一种用于纯化且富集选自以下的靶产物的方法：
‑
免疫球蛋白或其它蛋白质；或
‑
质粒
DNA、
基因组
DNA、RNA
或其它核酸；或
‑
病毒，所述方法包括下述步骤：
a.
提供含有靶产物的起始溶液；
b.
通过加入合适浓度的至少一种聚合物和至少一种盐
、
或通过加入合适浓度的至少两种聚合物，将起始溶液转换成水性双相系统；
c.
在维持质量转移的同时混合水性双相系统，使得靶产物在轻相
(20、120)
或重相
(40、140)
中富集；
d.
允许相在分离装置
(10、100)
中分离成轻相
(20、120)、
重相
(40、140)
和，如果存在中间相的话，中间相
(30、130)
；
e.
连续地测量在分离装置
(10、100)
中的至少一个相中的电导率，以确定两个相
(20、120、40、140)
和相界界面的位置，或者在中间相
(30、130)
的存在下，中间相
(30、130)
和两个相界界面的位置；
f.
基于在步骤
e.
中连续地测量的至少一个相的电导率，从分离装置
(10、100)
中去除轻相
(20、120)、
重相
(40、140)
以及在中间相
(30、130)
的存在下的中间相中的每一个；和
g.
提取具有靶产物的相
。2.
根据权利要求1的方法，其特征在于分离装置
(10、100)
中的至少一个相中的电导率的连续测量用以一个
、
两个
、
三个或更多个探头
(60、160.1、160.2、162.1、162.2、162.3、162.4、163.1、163.2、163.3、163.4)
形式的一种或多种电导率测量装置来进行，特别地，至少一个探头
(160.1、162.1、163.1)
用于在分离装置
(100)
中的合适位置处连续地测量重相
(140)
的电导率，并且至少一个探头
(160.2、162.3、162.4、163.3、163.4)
用于连续地测量轻相
(20、120)
的电导率
。3.
根据前述权利要求1至2之一的方法，其特征在于在分离装置
(10)
中提供出口
(50)
，并且通过重力或者使用由或者不由泵生成的正压或负压或者泵，来进行根据步骤
f.
通过出口
(50)
从分离装置
(10)
中的相
(10、20、30)
去除；或在分离装置
(100)
中提供上出口
(150.2)
，并且使用重力或者由或者不由泵生成的正压或负压或者泵，来进行从分离装置
(100)
的上出口
(150.2)
的轻相
(120)
去除，和在分离装置
(100)
中提供下出口
(150.1)
，并且使用重力或者由或者不由泵生成的正压或负压或者来自分离装置
(100)
的泵，来进行从分离装置
(100)
的下出口
(150.1)
的重相
(140)
去除
。4.
根据前述权利要求1至3之一的方法，其特征在于
借助于浸没在待去除的相中，具有开口
(190、192)
的高度可调的浸没管
(180、182)
，在连续操作中进行根据步骤
f.
的相去除，其中
‑
浸没管
(180)
以这样的方式连接到下出口
(150.2)
，使得相可以通过浸没管
(180)
中的开口
(182)
在重力下流出到出口
(150.1)
，或
‑
浸没管
(190)
具有开口
(192)
，通过其的相去除使用由或者不由泵生成的正压或负压或者泵来进行
。5.
根据前述权利要求1至4之一的方法，其特征在于所述高度可调的浸没管
(180、190)
与从顶部向底部延伸的套管
(183、193)
一起使用，其中所述浸没管
(180、190)
由具有用于去除相之一的开口
(182、192)
的高度可调的内管
(181、191)、
以及从顶部延伸到底部的套管
(183、193)
形成，并且套管
(183)
的长度由布置在轻相
(120)
上方的上端和下端
(183a、193a)
限定，其中套管
(183、193)
的直径调整为大于内管
(181、191)
的直径，使得在内管
(181、191)
和套管
(183、193)
之间形成中间空间，并且这样选择套管
(183)
的长度，使得套管
(183、193)
突出超过内管
(181、191)
的开口
(182、192)
，并且套管
(183、193)
的下端
(183a、193a)
浸没在重相
(140)
或如果存在的中间相
(130)
中，使得套管
(183、193)
的下端
(183a、193a)
浸没在其内的相的流体在中间空间中上升，并且可以通过内管
(181、191)
中的开口
(182、192)
离开
。
或使用具有从底部延伸到顶部的套管的高度可调的浸没管
(180、190)
，其中所述高度可调的浸没管由具有用于去除相之一的开口
(182、192)
的高度可调的内管
(181、191)、
以及从底部延伸到顶部的套管形成，并且套管的长度由布置在重相
(140)
下方的下端和上端限定，其中套管的直径调整为大于内管的直径，使得在内管
(181、191)
和套管之间形成中间空间，并且这样选择套管的长度，使得套管突出超过内管
(181、191)
的开口
(182、192)
，并且套管的上端浸没在轻相
(120)
或如果存在的中间相
(130)
中，使得套管的上端浸没在其中的相的流体流入中间空间内，并且可以通过内管
(181、191)
中的开口
(182、192)
离开
。6.
根据权利要求4或5的方法，其特征在于选择从顶部延伸到底部的套管
(183、193)
的长度及其直径，使得通过套管
(183、193)
防止悬浮物
、
絮凝物及其它固体或半固体组分进入内管
(181、191)
和套管
(183、193)
之间的中间空间内；或选择从底部延伸到顶部的套管的长度及其直径，使得通过套管防止悬浮物
、
絮凝物及其它固体或半固体组分进入内管和套管之间的中间空间内
。7.
根据前述权利要求1至6之一的方法，其特征在于用于轻相
(120)
的探头
(160.2、162.3、162.4、163.3、163.4)
放置低于分离装置
(100)
中的上出口
(150.2)
，而用于重相
(140)
的探头
(160.1、162.1、163.1)
放置高于分离装置
(100)
中的下出口
(150.1)
；
和
/
或使用具有或不具有套管
(183、193)
的浸没管
(180、190)
，其中，当使用不具有套管
(183、193)
的浸没管
(180、190)
时，用于去除重相
(140)
的浸没管
(180、190)
的开口
(182、192)
定位低于重相
(140)
中的探头
(160.1、162.1、163.1)
，并且其中用于去除轻相
(120)
的浸没管
(180、190)
的开口
(182、192)
定位高于轻相
(120)
中的探头
(160.2、162.3、162.4、163.3、163.4)
；和其中，当使用具有从顶部延伸到底部的套管
(183、193)
的浸没管
(180、190)
时，当重相
(140)
通过浸没管
(180、190)
的开口
(182、192)
去除时，用于去除重相
(140)
的套管
(183、193)
的下端
(183a、193a)
定位低于重相
(140)
中的探头
(160.1、162.1、163.1)
；和其中，当使用具有从底部延伸到顶部的套管的浸没管时，当轻相
(120)
通过浸没管的开口
(182、192)
去除时，用于去除轻相
(120)
的套管的上端定位高于轻相
(120)
中的探头
(160.2、162.3、162.4、163.3、163.4)。8.
根据前述权利要求1至7之一的方法，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：M，
申请(专利权)人：勃林格殷格翰国际公司，
类型：发明
国别省市：