一种诱导干细胞分化为肝细胞的试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，公开了一种诱导干细胞分化为肝细胞的试剂盒及其应用。该试剂盒包含：第一培养基和第二培养基；所述第一培养基为含有GSK3β抑制剂的基础培养基；所述第二培养基为含有Activin A的基础培养基；所述GSK3β抑制剂在所述第一培养基中的终浓度为6～12μM；所述Activin A在所述第二培养基中的终浓度为1～10ng/mL，不包含10ng/mL。该试剂盒通过小分子化合物GSK3β抑制剂以及低浓度的生长因子Activin A的组合搭配，替换高浓度且昂贵的生长因子Activin A和Wnt3a，在降低成本的同时，可以提高内胚层分化效率、肝细胞的功能、成熟度和质量。成熟度和质量。

【技术实现步骤摘要】
一种诱导干细胞分化为肝细胞的试剂盒及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种诱导干细胞分化为肝细胞的试剂盒及其应用。

技术介绍

[0002]近年来，肝脏疾病的发病率在显著增加，肝脏器官移植仍然是治疗末期肝脏疾病首要的方法，然而人类面临着严重的供体肝脏器官短缺的问题。为了有效缓解供体肝脏器官短缺的境况，临床上对肝病患者可以进行肝细胞移植治疗或对于急性肝衰患者可进行生物人工肝治疗。每次进行肝细胞移植治疗或生物人工肝治疗都需要100亿即10
10
数量级的肝细胞，此外，生物制药也需要大量人源肝细胞进行药物筛选、新药研发和毒理分析，因此如何获得高产以及高质量的肝细胞成为一种迫切社会需求。
[0003]目前临床和生物制药市场上，原代人肝细胞(PHH)大多来自于病人手术摘除的肝癌组织或捐赠的肝脏，不仅数量有限，而且难以在体外扩增培养，培养后常常导致原代人肝细胞的功能丧失。即便肝细胞可从其他来源如人肝肿瘤细胞系、永生化的人肝细胞系或猪肝细胞中获取，但是，所有这些细胞应用都受到着许多因素限制，例如培养或移植后功能降低、细胞批次差异以及面临着人畜共患病感染的风险。由于人多能干细胞的巨大的潜力以及广泛的应用，通过人多能干细胞定向分化成肝细胞为细胞移植治疗或人工肝治疗提供了无限的可能。
[0004]目前，研究人员们正在进行大量研究，专注于通过人多能干细胞的分化获得稳定来源的功能性肝细胞。人多能干细胞向肝细胞定向分化主要有以下三个阶段：其一是诱导内胚层细胞分化阶段即人多能干细胞分化为内胚层细胞；其二是肝细胞分化阶段即内胚层细胞向肝祖细胞分化；其三是肝细胞成熟阶段即肝祖细胞分化为功能性的肝细胞。
[0005]由于二维培养分化体系无法模拟人体内肝脏的三维微环境，通过此分化体系所获得的肝细胞的成熟度以及功能不够高。因此，科研人员尝试发展多种3D悬浮培养条件下的分化方法，包括多种细胞共培养以及聚集体悬浮分化，通过这些分化方法能够获得成熟度更高的肝细胞，进而获得更适用于药物筛选的细胞，通过药物代谢能力真实地反应药物的药代动力学以及毒理作用。许多研究者也证明使用原代肝细胞或分化的肝细胞与肝脏非实质细胞(内皮细胞和星状细胞)共培养将会提高其肝细胞球功能，重现复杂的生物体内微环境。2D贴壁培养分化系统过渡到3D悬浮培养分化系统，不仅增强了肝细胞的功能，同时也促进了它们在人工肝治疗应用中的发展，使用体外人工肝装置能够减轻患肝病者的压力，救治肝衰竭病人的生命。
[0006]因此，为了获得大量的功能性以及成熟度高的肝细胞，近年来研究热点聚焦在通过使用小分子化合物替代昂贵的生长因子，如何在3D悬浮培养条件下将多能干细胞定向诱导分化为肝细胞。

技术实现思路

[0007]本专利技术第一方面的目的，在于提供一种诱导干细胞分化为肝细胞的试剂盒。
[0008]本专利技术第二方面的目的，在于提供第一方面的试剂盒的应用。
[0009]本专利技术第三方面的目的，在于提供一种诱导干细胞为内胚层细胞的方法。
[0010]本专利技术第四方面的目的，在于提供一种诱导干细胞为肝祖细胞的方法。
[0011]本专利技术第五方面的目的，在于提供一种诱导干细胞为肝细胞的方法。
[0012]为了实现上述目的，本专利技术所采取的技术方案是：
[0013]本专利技术的第一个方面，提供一种诱导干细胞分化为肝细胞的试剂盒，包含：第一培养基和第二培养基；所述第一培养基为含有GSK3β抑制剂的基础培养基；所述第二培养基为含有Activin A的基础培养基；所述GSK3β抑制剂在所述第一培养基中的终浓度为6～12μM；所述Activin A在所述第二培养基中的终浓度为1～10ng/mL，不包含10ng/mL。
[0014]优选地，所述GSK3β抑制剂为CHIR99021。
[0015]优选地，所述第一培养基还包含B27和BSA。
[0016]优选地，所述B27在所述第一培养基中的终浓度为1X～2X。
[0017]优选地，所述BSA在所述第一培养基中的终浓度为0.1～0.5w/w％。
[0018]优选地，所述第二培养基还包含B27和BSA。
[0019]优选地，所述B27在所述第二培养基中的终浓度为1X～2X。
[0020]优选地，所述BSA在所述第二培养基中的终浓度为0.1～0.5w/w％。
[0021]优选地，所述诱导干细胞分化为肝细胞的试剂盒包含：第一培养基和第二培养基；所述第一培养基为含有6～12μM GSK3β抑制剂、1X～2X B27和0.1～0.5w/w％BSA的基础培养基；所述第二培养基为含有1～10ng/mL(不包含10ng/mL)Activin A、1X～2X B27和0.1～0.5w/w％BSA的基础培养基。
[0022]进一步优选地，所述诱导干细胞分化为肝细胞的试剂盒包含：第一培养基和第二培养基；所述第一培养基为含有6μM GSK3β抑制剂、1X B27和0.1w/w％BSA的基础培养基；所述第二培养基为含有1ng/mL Activin A、1X B27和0.1w/w％BSA的基础培养基。
[0023]在本专利技术中，第一培养基和第二培养基用于诱导干细胞分化为内胚层细胞。
[0024]优选地，所述诱导干细胞分化为肝细胞的试剂盒还包含：第三培养基，所述第三培养基为含有FGF
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4、HGF、BMP2和BMP4的基础培养基；所述FGF
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4在所述第三培养基中的终浓度为20～40ng/mL；所述HGF在所述第三培养基中的终浓度为20～40ng/mL；所述BM P2在所述第三培养基中的终浓度为10～20ng/mL；所述BMP4在所述第三培养基中的终浓度为10～20ng/mL。
[0025]优选地，所述第三培养基还包含：FBS、L
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谷氨酰胺、胰岛素、1
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硫代甘油、二甲基亚砜和地塞米松。
[0026]优选地，所述FBS在所述第三培养基中的终浓度为20～40w/w％。
[0027]优选地，所述L
‑
谷氨酰胺在所述第三培养基中的终浓度为2～3mM。
[0028]优选地，所述胰岛素在所述第三培养基中的终浓度为0.126～0.252U/mL。
[0029]优选地，所述1
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硫代甘油在所述第三培养基中的终浓度为0.3～0.4mM。
[0030]优选地，所述二甲基亚砜在所述第三培养基中的终浓度为0.5～0.6w/w％。
[0031]优选地，所述地塞米松在所述第三培养基中的终浓度为100～150nM。
[0032]优选地，所述第三培养基为含有20～40ng/mL FGF
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4、20～40ng/mL HGF、10～20ng/mL BMP2、10～20ng/mL BMP4、20～40w/w％FBS、2～3mM L
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谷氨酰胺、0.126～0.252U/mL胰岛素、0本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种试剂盒，包含：第一培养基和第二培养基；所述第一培养基为含有GSK3β抑制剂的基础培养基；所述第二培养基为含有Activin A的基础培养基；所述GSK3β抑制剂在所述第一培养基中的终浓度为6～12μM；所述Activin A在所述第二培养基中的终浓度为1～10ng/mL，不包含10ng/mL。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包含：第三培养基，所述第三培养基为含有FGF
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4、HGF、BMP2和BMP4的基础培养基；所述FGF
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4在所述第三培养基中的终浓度为20～40ng/mL；所述HGF在所述第三培养基中的终浓度为20～40ng/mL；所述BMP2在所述第三培养基中的终浓度为10～20ng/mL；所述BMP4在所述第三培养基中的终浓度为10～20ng/mL。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包含：第四培养基，所述第四培养基为含有HGF、FGF
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4和抑瘤素M的基础培养基；所述FGF
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4在所述第四培养基中的终浓度为20～40ng/mL；所述HGF在所述第四培养基中的终浓度为20～40ng/mL；所述抑瘤素M在所述第四培养基中的终浓度为50～100ng/mL。4.根据权利要求1～3中任一项所述的试剂盒，其特征在于：所述第一培养基还包含B27和BSA；优选地，所述第二培养基还包含B27和BSA；优选地，所述第三培养基还包含：FBS、L
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谷氨酰胺、胰岛素、1
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硫代甘油、二甲基亚砜和地塞米松；优选地，所述第四培养基还包含：二甲基亚砜、地塞米松和第一添加剂；优选地，所述第一添加剂包含以下组分：抗坏血酸、BSA
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FAF、氢化可的松、转铁蛋白、胰岛素、基因重组人表皮生长因子和GA
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1000。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：段玉友，唐湘莲，吴海滨，陈洪林，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：