基于干细胞/类器官技术的珍稀濒危动物中药材替代品的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种基于干细胞/类器官技术的珍稀濒危动物中药材替代品的制备方法，所述方法包括：将珍稀濒危野生药用动物具有“干性”的细胞或组织植入组织工程支架，添加生长因子，继续培养。本发明专利技术还公开了干细胞和/或类器官在培养动物中药材替代品的用途。本发明专利技术的方法可以制备得到与中药材药用部位十分接近的替代品，有利于缓解濒危中药材的紧缺，助推中药产业高质量可持续的发展与野生动物保护事业的和谐发展。业的和谐发展。业的和谐发展。

【技术实现步骤摘要】
基于干细胞/类器官技术的珍稀濒危动物中药材替代品的制备方法


[0001]本专利技术属于组织细胞培养领域，具体涉及一种基于干细胞/类器官技术的珍稀濒危动物中药材替代品的制备方法。

技术介绍

[0002]基于中医临床用药需求，珍稀濒危动物药一直是不可或缺的一部分，且对临床疗效起着关键作用，如穿山甲片、麝香、虎骨、熊胆粉、赛加羚羊角等等。随着人们对中医药认可程度提高，以及对健康的重视，中药的需求量呈快速增长的趋势，临床上对珍稀濒危动物药材的需求量也不断扩大。
[0003]目前，大部分药用珍稀濒危动物的人工养殖技术难以突破，野生资源匮乏，对野生资源带来负面影响。国家对珍稀濒危动物保护力度日益加强，珍稀濒危动物药材短缺，已造成部分中医经典名方缺乏完整性，制约了传统中医药临床疗效的发挥。国家法律对濒危药材使用的禁止性规定，已成为中医事业传承发展的痛点及瓶颈。
[0004]在中医药学中，穿山甲鳞甲是非常珍稀的动物药材。药用穿山甲为鲮鲤科动物穿山甲的鳞甲，功效为活血散结，通经下乳，消痈溃坚。临床上常用于治疗血瘀经闭，症瘕，风湿痹痛，乳汁不下，痈肿，瘰疬等症。但是近年来由于过度捕杀和生存环境的被破坏，穿山甲资源变得极度稀缺。根据2014 年世界自然保护联盟的评估，世界上的8种穿山甲都是危险的。其中，中国穿山甲和马来穿山甲被列为“极其危险”物种，比大熊猫评级“弱势”高两级，仅次于野外灭绝和灭绝。羚羊角始载于《神农本草经》，为牛科动物赛加羚羊的角，属于名贵中药材，其性寒，味咸，归肝、心经，具有平肝熄风、清肝明目、散血解毒等功效，主治肝风内动、惊痫抽搐、妊娠子痫、高热痉厥、癫痫发狂、头痛眩晕、目赤翳障、温毒发斑、痈肿疮毒等症。因赛加羚羊主要分布于中亚地区，由于偷猎和过度捕猎泛滥，致使其数量锐减到不足原数量的5％，赛加羚羊已被世界自然保护联盟(IUCN)列入了世界濒危动物红色名录。熊胆，为熊科动物黑熊或棕熊的胆囊。中医认为熊胆汁有清热解毒、平肝明目、杀虫止血的功效。因此，亚洲各国都有延续数千年的杀熊取胆的传统。随着现代医学的发展和动物保护意识的觉醒，猎熊取胆的行为逐步减少，熊胆粉药材短缺。
[0005]为了在加强珍稀濒危野生药用动物保护的同时解决药材临床使用面临的资源限制，打破阻碍中医药事业发展的关键瓶颈问题，开发新的中药材替代品意义重大。

技术实现思路

[0006]本专利技术要解决的问题是：提供一种基于干细胞/类器官技术的珍稀濒危动物中药材替代品的制备方法。
[0007]本专利技术的技术方案如下：
[0008]干细胞和/或类器官在培养动物中药材替代品的用途。
[0009]如前述的用途，所述动物为濒危动物。
[0010]进一步地，所述动物中药材为动物全体、皮肤、皮肤附属物(角、鳞甲等)、器官分泌产物或骨；优选地，动物中药材为穿山甲、麝香、熊胆粉、羚羊角、虎骨、豹骨、犀牛角、象皮或鹿茸。
[0011]一种基于干细胞/类器官技术的动物中药材替代品的制备方法，所述方法包括：
[0012]取中药材对应基源动物细胞和/或组织，植入组织工程支架，培养，添加生长因子，继续培养，得到替代品；或，取中药材对应基源动物的细胞和/ 或组织，纯化分化或扩增分化培养，得到替代品；
[0013]所述细胞为具有干性的细胞和/或无干性的细胞。
[0014]进一步地，添加生长因子之前的培养时间为4小时～14天。
[0015]进一步地，所述生长因子包括EGF。
[0016]进一步地，所述动物为濒危动物。
[0017]进一步地，所述动物中药材为动物全体、皮肤、皮肤附属物(鳞甲、角等)、器官分泌产物或骨；优选地，动物中药材为穿山甲、麝香、熊胆粉、羚羊角、虎骨、豹骨、犀牛角、象皮或鹿茸。
[0018]进一步地，所述动物中药材为动物皮肤或皮肤附属物时，所述细胞为表皮干细胞和角质形成细胞，优选地，表皮干细胞与角质形成细胞的数量比为 3:1。
[0019]进一步地，所述细胞按照100000
‑
500000细胞/平方厘米的种植密度接种于组织工程支架上。
[0020]进一步地，制备所述组织工程支架的材料包括水凝胶微球，及其外部包裹人造医用高分子材料；
[0021]所述水凝胶微球由壳聚糖、胶原、透明质酸钠、硫酸软骨素等中的至少一种制成；
[0022]所述人造医用高分子材料由聚己内酯、聚酰胺、聚乳酸、聚乳酸
‑
羟基乙酸共聚物、聚羟基乙酸等中的至少一种制成。
[0023]进一步地，所述水凝胶由胶原、透明质酸钠、硫酸软骨素中的至少一种制成。
[0024]进一步地，所述医用高分子材料为聚己内酯。
[0025]进一步地，所述动物中药材为器官分泌产物时，所述细胞为器官组织分离消化得到的细胞；优选的，所述中药材为熊胆粉，所述细胞为熊的肝脏组织分离消化得到的细胞。
[0026]更进一步地，上述细胞扩增、分化培养得到替代品。
[0027]更进一步地，包括如下步骤：
[0028](1)器官组织分离消化得到的细胞重悬在基底基质中，固化后加入扩增培养基培养7～9天，每2～3天更换新鲜的扩增培养基；
[0029](2)将培养基更换为分化培养基分化培养，培养4～6天，每天更换新鲜的分化培养基；
[0030](3)补充添加30μM地塞米松的分化培养基，每天更换新鲜的添加30μM 地塞米松的分化培养基，继续分化培养5～7天；
[0031]所述扩增培养基包括如下组分：基础培养基、B27、氨基酸、细胞因子和激素。
[0032]所述分化用的分化培养基包括如下组分：基础培养基、B27、氨基酸、细胞因子、小分子抑制剂和激素。
[0033]更进一步地，上述基础培养基包括ADMEM/F
‑
12、青霉素和链霉素、谷氨酰胺和
HEPES；
[0034]所述氨基酸包括N
‑
乙酰半胱氨酸、烟酰胺中的至少一种；
[0035]所述细胞因子包括Rspo1、EGF、FGF、HGF、FSK、Noggin、Wnt 3A 中的至少一种；
[0036]所述小分子抑制剂包括γ
‑
secretase抑制剂、ALK4/5/7抑制剂中的至少一种，所述γ
‑
secretase抑制剂包括DAPT，所述ALK4/5/7抑制剂包括A8301；
[0037]所述激素包括胃泌素。
[0038]更进一步地，上述基础培养基由如下组分组成：1％青霉素和链霉素、1％谷氨酰胺、10mM HEPES，余量为DMEM/F
‑
12；
[0039]上述扩增所用的扩增培养基由如下组分组成：1％～2％B27、 1mM～1.25mM N
‑
乙酰半胱氨酸、10mM烟酰胺、100～250ng/mL Rspo1、 50ng/mL EGF、100ng/mL FGF、25～50ng/mL HGF、10μM FSK本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.干细胞和/或类器官在培养动物中药材替代品的用途。2.如权利要求1所述的用途，其特征在于：所述动物为濒危动物。3.如权利要求2所述的用途，其特征在于：所述动物中药材为动物全体、皮肤、皮肤附属物、器官分泌产物或骨；优选地，动物中药材为穿山甲、麝香、熊胆粉、羚羊角、虎骨、豹骨、犀牛角、象皮或鹿茸。4.一种基于干细胞/类器官技术的动物中药材替代品的制备方法，其特征在于：所述方法包括：取中药材对应基源动物的细胞和/或组织，植入组织工程支架，培养，添加生长因子，继续培养，得到替代品；或，取中药材对应基源动物的细胞和/或组织，纯化分化或扩增分化培养，得到替代品；所述细胞为具有干性的细胞和/或无干性的细胞。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：添加生长因子之前的培养时间为4小时～14天。6.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述生长因子包括EGF。7.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述动物为濒危动物。8.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述动物中药材为动物全体、皮肤、皮肤附属物、器官分泌产物或骨；优选地，动物中药材为穿山甲、麝香、熊胆粉、羚羊角、虎骨、豹骨、犀牛角、象皮或鹿茸。9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：所述动物中药材为动物皮肤或皮肤附属物，所述细胞为表皮干细胞和角质形成细胞，优选地，表皮干细胞与角质形成细胞的数量比为3:1。10.如权利要求9所述的方法，其特征在于：所述细胞按照100000
‑
500000细胞/平方厘米的种植密度接种于组织工程支架上，培养，添加生长因子，继续培养，得到替代品。11.如权利要求4～10任一所述的方法，其特征在于：制备所述组织工程支架的材料包括水凝胶微球，及其外部包裹人造医用高分子材料；所述水凝胶微球由壳聚糖、胶原、透明质酸钠、硫酸软骨素等中的至少一种制成；所述人造医用高分子材料由聚己内酯、聚酰胺、聚乳酸、聚乳酸
‑
羟基乙酸共聚物、聚羟基乙酸等中的至少一种制成。12.如权利要求11所述的方法，其特征在于：所述水凝胶由胶原、透明质酸钠、硫酸软骨素中的至少一种制成。13.如权利要求12所述的方法，其特征在于：所述医用高分子材料为聚己内酯。14.如权利要求8所述的方法，其特征在于：所述动物中药材为器官分泌产物时，所述细胞为器官组织分离消化得到的细胞；优选的，所述中药材为熊胆粉，所述细胞为熊的肝脏组织分离消化得到的细胞。15.如权利要求14所述的方法，其特征在于：所述细胞扩增、分化培养得到替代品。16.如权利要求15所述的方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)器官组织分离消化得到的细胞重悬在基底基质中，固化后加入扩增培养基培养7～9天，每2～3天更换新鲜的扩增培养基；(2)将培养基更换为分化培养基分化培养，培养4～6天，每天更换新鲜的分化培养基；
(3)补充添加30μM地塞米松的分化培养基，每天更换新鲜的添加30μM地塞米松的分化培养基，继续培养5～7天；所述扩增培养基包括如下组分：基础培养基、B27、氨基酸、细胞因子和激素；所述分化培养基包括如下组分：基础培养基、B27、氨基酸、细胞因子、小分子抑制剂和激素。17.如权...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴纯洁，吴晓川，叶洵，刘子博，彭伟，申重阳，
申请(专利权)人：成都中医药大学，
类型：发明
国别省市：