构建原位原发胃癌动物模型的方法技术

本发明专利技术公开了一种原位原发的胃癌肿瘤模型制备方法，属于肿瘤动物模型领域。本发明专利技术通过将小鼠胃上皮细胞以特定培养基培养成类器官，再将类器官进行遗传改造，注射回小鼠胃，使其发展成肿瘤。本发明专利技术的方法相比移植瘤动物模型，具有明确的基因突变背景，能够有效模拟人体胃癌发生发展的真实过程。相比基因工程肿瘤动物模型，本发明专利技术可以高效构建具有不同基因突变背景的胃癌小鼠模型，耗时短，成本低，成瘤率高。高。高。

【技术实现步骤摘要】
构建原位原发胃癌动物模型的方法


[0001]本专利技术属于肿瘤动物模型领域。

技术介绍

[0002]胃癌已成为我国发病率第二，死亡率第三的肿瘤。然而近二十年来，胃癌的临床治疗并未取得突破性进展。深入了解胃癌发生机制，找到其中的关键作用因子，进而研发更加有效的治疗手段，显得尤为迫切。肿瘤动物模型在探究肿瘤发生发展机制、研发新药物上扮演着至关重要角色。小鼠胃癌模型为研究胃癌发生与转移机制、抗肿瘤药物筛选、免疫治疗评价等方面、提供有力的工具。
[0003]目前，常用的小鼠胃癌模型，主要包括移植瘤模型和自发成瘤模型。移植瘤模型是采用的免疫缺陷小鼠(如无胸腺裸鼠、SCID小鼠)作为移植受体,将肿瘤细胞(细胞系)或肿瘤组织块移植进免疫缺陷鼠体内后形成移植肿瘤。自发成瘤模型主要包括：基因工程小鼠胃癌模型和化学诱导小鼠胃癌模型。已有报道的基因工程小鼠胃癌模型主要包括:INS-GAS小鼠、TFF-1敲除小鼠和RunnX3敲除小鼠。这些小鼠均是利用小鼠胚胎干细胞的基因同源重组，将特定基因在小鼠基因组上敲除或敲入。化学诱导小鼠胃癌模型，是利用化学致癌物质长期刺激诱发胃癌发生，常用的药物包括亚硝基化合物MNNG和MNU。
[0004]但是，目前的小鼠胃癌模型存在诸多缺点，在满足基础以及临床前研究需求都存在不足。小鼠移植瘤胃癌模型一直都饱受争议，因为移植瘤并非小鼠机体自发形成的肿瘤，不能反映体内肿瘤形成的真实过程；更重要的是，机体的免疫系统在肿瘤形成过程中十分重要，而免疫缺陷小鼠缺乏完整的免疫系统，利用移植瘤胃癌模型已经不能满足肿瘤免疫学治疗研究的需要。基于基因工程小鼠的自发成瘤模型因其类似人体内肿瘤的发生过程而得到认可，但是肿瘤的发生是多个基因累积改变的过程，传统基因工程小鼠单次只引入一至两个基因改变，若想获得多个基因突变小鼠，需要多次交配迭代；耗时长，若要同时获得大量相同基因型的肿瘤小鼠，需要更多的亲代小鼠，研究成本提高。同时，由于基因工程小鼠是生殖系突变，容易诱发多系统多器官的肿瘤，这与肿瘤实际发生情况也有差异；并且由于小鼠个体差异，自发成瘤的周期差异也较大，难以达到同步。更重要的是，基因工程小鼠构建技术门槛高，若要构建新的基因型小鼠模型周期长成本高，一般研究机构无法常规开展。对于化学诱导小鼠胃癌模型，该类模型构建时间相对较长，成瘤具有明显的个体差异，高异质性可能会造成后期数据的处理难度增加，文献报道，总体成瘤在50％左右。最重要的是该类模型缺乏明确的基因操作，不适用于发病机理研究。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种更接近胃癌生物学特性、且制备周期短的原位原发胃癌模型。
[0006]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供了以下技术方案：
[0007]一种构建原位原发胃癌动物模型的方法，其特征在于，包括：
[0008]将遗传改造的胃类器官注射到动物胃组织内；
[0009]所述遗传改造是指敲除抑癌基因，和/或过表达癌基因。
[0010]进一步地，所述遗传改造具体为如下任一情形：
[0011]a.敲除TP53、PTEN、SMAD4基因；
[0012]b.敲除TP53、APC、CDKN2A、MLL3基因；
[0013]c.敲除TP53、CDH1、ARID1A基因，过表达MYC基因。
[0014]进一步地，所述胃癌为胃腺癌。
[0015]进一步地，所述遗传改造还包括对类器官转入荧光标记基因。
[0016]进一步地，所述动物是小鼠。
[0017]前述的方法制备得到的动物模型在药物筛选、药物毒性试验或免疫治疗试验中应用。
[0018]一种胃类器官培养基，所述培养基是在DMEM/F12培养基的基础上，加上如下添加剂得到：
[0019]成分含量成分含量B2740～100倍稀释EGF50～200ng/mlR-spondin 1200～300ng/mlY-276325～40μMGlutamax100倍稀释Gastrin1～10nMN-acetylcysteine0.5～5mMNoggin50～200ng/mlA83-01100～300nMNicotinamide5～20mMWNT3a50～200ng/mlN250～200倍稀释。
[0020]如前述的胃类器官培养基，所述培养基是在DMEM/F12培养基的基础上，加上如下添加剂得到：
[0021]成分含量成分含量B2750倍稀释EGF50ng/mlR-spondin 1250ng/mlY-2763210μMGlutamax100倍稀释Gastrin1nMN-acetylcysteine1mMNoggin100ng/mlA83-01200nMNicotinamide10mMWNT3a50ng/mlN2100倍稀释。
[0022]一种胃类器官的培养方法，包括如下步骤：
[0023]1)胃粘膜上皮细胞混合基质胶Matrigel；
[0024]2)待Matrigel凝固，使用权利要求7或8所述培养基培养得到类器官。
[0025]进一步地，步骤1)的胃粘膜上皮细胞是原代培养的胃粘膜上皮细胞；
[0026]优选地，所述原代培养的胃细胞的制备方法如下：
[0027]a)取动物胃，洗净胃内容物，剪碎至2-3mm大小组织块；
[0028]b)用含有Y27632 10μM、EDTA 5mM的DPBS溶液，在冰上预消化30分钟后，用1ml移液枪吹打10-20次；
[0029]c)静置，待未消化组织块自然沉降，收集上清液，离心，弃上清；
[0030]d)用TrypLE消化，得胃粘膜上皮细胞的单细胞悬液。
[0031]本专利技术的有益效果：
[0032]本专利技术的肿瘤模型构建周期较基因工程动物模型大大缩短，不会导致动物成瘤前死亡，成瘤率高达100％。
[0033]本专利技术构建的原位原发的小鼠胃肿瘤模型，可模拟在人体内由于遗传改变导致正常细胞向肿瘤细胞转化的过程，能动态地表征肿瘤发生发展地过程，在基因层面、肿瘤微环境、肿瘤发展及病理生理等方面与肿瘤发生发展真实情况更加贴近。
[0034]总之，本专利技术的方法可高效率地制备得到更接近胃癌特征、符合临床研究需求的胃癌模型；该模型可以在探究胃癌发生发展机制、寻找和优化新的胃癌可能的治疗方式等研究领域提供有利工具。
[0035]显然，根据本专利技术的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本专利技术上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0036]以下通过实施例形式的具体实施方式，对本专利技术的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本专利技术上述内容所实现的技术均属于本专利技术的范围。
附图说明
[0037]图1：实验例1中类器官显微观察。
[0038]图2：实验例1中类器官T7内切酶检测。
[0039]图3：实验例1中小鼠肿瘤的荧光素酶活体成像。<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种构建原位原发胃癌动物模型的方法，其特征在于，包括：将遗传改造的胃类器官注射到动物胃组织内；所述遗传改造是指敲除抑癌基因，和/或过表达癌基因。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述遗传改造具体为如下任一情形：a.敲除TP53、PTEN、SMAD4基因；b.敲除TP53、APC、CDKN2A、MLL3基因；c.敲除TP53、CDH1、ARID1A基因，过表达MYC基因。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述胃癌为胃腺癌。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述遗传改造还包括对类器官转入荧光标记基因。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述动物是小鼠。6.权利要求1～5任一所述的方法制备得到的动物模型在药物筛选、药物毒性试验或免疫治疗试验中应用。7.一种胃类器官培养基，其特征在于：所述培养基是在DMEM/F12培养基的基础上，加上如下添加剂得到：成分含量成分含量B2740～100倍稀释EGF50～200ng/mlR-spondin 1200～300ng/mlY-276325～40μMGlutamax100倍稀释Gastrin1～10nMN-...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈崇，陆政昊，刘玉，
申请(专利权)人：四川大学华西医院，
类型：发明
国别省市：