一种体外子宫内膜腺体类器官的三维培养方法技术

本发明专利技术涉及一种体外子宫内膜腺体类器官的三维培养方法。具体地，本发明专利技术涉及体外子宫内膜腺体类器官的三维培养、传代、冷冻、解冻方法、以及由所述方法获得的体外子宫内膜腺体类器官以及其用途。器官以及其用途。

【技术实现步骤摘要】
一种体外子宫内膜腺体类器官的三维培养方法


[0001]本专利技术属于生物医药
，主要涉及一种人子宫内膜腺体类器官的三维培养方法。

技术介绍

[0002]子宫是一个复杂的器官，其内部子宫内膜由单层假复层腔上皮(LE)和分支的柱状腺上皮(GE)组成，并由间质成纤维细胞以及免疫细胞，血管和淋巴系统支持，这些腺体被认为通过与其他子宫内膜细胞和胚胎的相互作用对建立妊娠很重要。同时，子宫内膜是人体中最有活力的组织之一，每月经历激素调节的生长周期和脱落。有证据表明，子宫内膜干/祖细胞负责子宫内膜的再生特性。
[0003]人类的胚胎植入的过程是一项复杂的生理过程，目前，没有理想的体外模型对这一过程进行研究，胚胎植入过程一直被称为生殖领域的“黑匣子”。然而，这一过程中的任何异常都会导致疾病，例如不孕症、先兆流产等。
[0004]另一方面，子宫内膜疾病是常见的妇科问题，也是不孕症的主要原因之一。由子宫内膜样组织异位生长引起的子宫内膜异位症影响了10％的育龄妇女，但由于缺乏合适的研究模型，其病因和发病机制仍不清楚，治疗仍不能令人满意。子宫内膜癌(EC)是第四大最常见的女性癌症，具有雌激素依赖性的I型EC的预后良好，而具有雌激素依赖性的II型EC的预后较差并伴有高转移风险。临床上由于缺乏可靠的临床前研究模型，导致EC病理生物学的基本机制仍然未知，治疗效率和总生存率也没有实质性改善。
[0005]迄今为止，鉴于子宫内膜基质细胞易于生长、繁殖和传代，子宫内膜的研究主要集中在基质细胞的研究上，当子宫内膜上皮细胞及腺体细胞以单层培养时，上皮细胞及腺体细胞具有细胞生长不良，衰老，丧失极性和不能传代扩增的特征。这一直是女性生殖系统研究领域的最大障碍之一，也正因为如此，由子宫内膜因素引起的不育及子宫内膜癌的致病机理仍不清楚。同时，传统二维细胞培养方法使培养细胞处于同一平面，长时间培养后，其形态特性、生理功能、遗传物质等均与来源细胞产生较大差异，对临床研究的参考意义有限。类器官(organoid)是将组织干细胞在体外进行培养，保持原始干细胞功能并不断分裂分化形成在空间和结构与来源器官组织、基因、结构和功能相似的微组织。与现有二维培养相比，类器官是不同类型和功能细胞的有机结合体，更接近体内细胞生存空间、生长状态及功能。类器官以其在体外长期增殖、可传代性、高度保持源器官结构和功能等特性在生物医学领域备受关注。目前类器官在机体生长发育、疾病病理、药物筛选及毒理学评价、再生医学、生物材料等研究中显示出巨大潜力。
[0006]目前国内还未有关于利用人子宫内膜诊刮组织体外进行人子宫内膜腺体类器官的三维培养、传代、冻存、复苏的方法，成功在体外构建人子宫内膜腺体类器官，可以使我们更好的研究子宫内膜生理过程及病理疾病，可用于临床前药物筛选、用药安全性及生殖毒性的检测，在临床上可以作为“精准治疗”和“个性化治疗”的有力工具，帮助促进子宫内膜疾病的研究。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于提供一种人子宫内膜腺体类器官的三维培养方法，旨在解决目前国内还未有关于利用人子宫内膜诊刮组织体外进行人子宫内膜腺体类器官的三维培养、传代、冻存、复苏方法的问题；
[0008]为了达到上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0009]一种人子宫内膜腺体类器官的三维培养的方法，包括以下步骤：
[0010]步骤1:获取子宫内膜组织；
[0011]步骤2:利用多种酶溶解液将所述子宫内膜组织解离为完整的腺体片段；
[0012]步骤3:将所述的子宫内膜完整的腺体片段接种到基质胶中进行三维培养并建立子宫内膜腺体类器官模型；
[0013]步骤4:扩大培养所述的子宫内膜腺体类器官并建立子宫内膜腺体类器官系；
[0014]步骤5:冻存子宫内膜腺体类器官并建立子宫内膜腺体类器官库；
[0015]步骤6:复苏子宫内膜腺体类器官并重新培养。
[0016]在本专利技术的一个方面，本专利技术提供了一种体外子宫内膜腺体类器官的三维培养方法，所述方法包括：
[0017]1)获得哺乳动物子宫内膜组织，
[0018]2)洗涤所述哺乳动物子宫内膜组织，并剪成碎片，
[0019]3)将剪碎的哺乳动物子宫内膜组织与胶原酶V和分散酶II混合，在37摄氏度下孵育10分钟到120分钟，优选地20
‑
110分钟，优选地30
‑
100、30
‑
90、30
‑
80、30
‑
70、30
‑
60分钟；或其之间的任何点值；
[0020]4)将步骤3)中的混合液通过细胞筛过滤，反向冲洗残留在细胞筛表面的腺体；优选地，所述细胞筛孔径为10
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200微米，优选地20
‑
180、30
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160、40
‑
150、50
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130、60
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120、70
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100微米，或其之间的任何点值；
[0021]5)离心后收集完整的子宫内膜腺体片段；
[0022]6)将步骤5)中获得的完整的子宫内膜腺体片段与液体基质胶Matrigel混合后铺板，优选地，体积比为1:5至1:100；优选地，体积比为1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:100；或其间的任意点值；
[0023]7)将铺板后的完整的子宫内膜腺体片段与液体基质胶Matrigel混合物置于37摄氏度、湿度为5％的二氧化碳中20分钟，使基质胶固化；和
[0024]8)向固化的基质胶中加入子宫内膜腺体类器官条件培养基，在37摄氏度、湿度为5％的二氧化碳中培养，获得子宫内膜腺体类器官；
[0025]优选地，所述子宫内膜腺体类器官条件培养基为添加有N
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乙酰
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L
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半胱氨酸、烟酰胺、重组人R
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sponding
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1、重组人FGF
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10、A
‑
83
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01、抗生素的DMEM/F12培养基。
[0026]优选地，在上述方法的步骤3)中，进一步包括每隔10分钟将孵育容器震荡一次，在倒置显微镜下观察子宫内膜腺体消化情况的步骤。
[0027]进一步地，本专利技术的方法包括扩大培养的步骤，其在步骤8)之后进一步包括：
[0028]9)用细胞回收液取代步骤8)中的子宫内膜腺体类器官条件培养基，移入离心管中，
[0029]10)通过吹打离心管，使子宫内膜腺体类器官团块分散，
[0030]11)离心，获得沉淀物，和
[0031]12)重复上述步骤6)至8)，进行扩大培养。
[0032]通过本专利技术的所述扩大培养的步骤，可对子本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种体外子宫内膜腺体类器官的三维培养方法，所述方法包括：1)获得哺乳动物子宫内膜组织，2)洗涤所述哺乳动物子宫内膜组织，并剪成碎片，3)将剪碎的哺乳动物子宫内膜组织与胶原酶V和分散酶II混合，在37摄氏度下孵育10分钟到120分钟，优选地20
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110分钟，优选地30
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100、30
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90、30
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80、30
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70、30
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60分钟；或其之间的任何点值；4)将步骤3)中的混合液通过细胞筛过滤，反向冲洗残留在细胞筛表面的腺体；优选地，所述细胞筛孔径为10
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200微米，优选地20
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180、30
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160、40
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150、50
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130、60
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120、70
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100微米，或其之间的任何点值；5)离心后收集完整的子宫内膜腺体片段；6)将步骤5)中获得的完整的子宫内膜腺体片段与液体基质胶Matrigel混合后铺板，优选地，体积比为1:5至1:100；优选地，体积比为1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:100；或其间的任意点值；7)将铺板后的完整的子宫内膜腺体片段与液体基质胶Matrigel混合物置于37摄氏度、湿度为5％的二氧化碳中20分钟，使基质胶固化；和8)向固化的基质胶中加入子宫内膜腺体类器官条件培养基，在37摄氏度、湿度为5％的二氧化碳中培养，获得子宫内膜腺体类器官；优选地，所述子宫内膜腺体类器官条件培养基为添加有N
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乙酰
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【专利技术属性】
技术研发人员：张雷，张亚楠，盖波，张轶，商微，
申请(专利权)人：辽宁格瑞仕特生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：