一种诱导间充质干细胞向胰岛β细胞分化的方法技术

本发明专利技术涉及生物医学领域，具体涉及一种诱导间充质干细胞向胰岛β细胞分化的方法。本发明专利技术提供的方法，包括预诱导和正式诱导，所述方法通过获得特定的细胞外囊泡(EV)，可以实现微囊泡(MV)诱导间充质干细胞(MSC)出现胰岛样细胞形态学变化。具体地，本发明专利技术提供的诱导方法，使得MV在胰岛β细胞诱导分化中起主导作用。本发明专利技术提供的诱导方法，是一种EV介导的细胞间通讯真正用于干细胞诱导分化领域的新方式。本发明专利技术所述诱导方法的诱导效率非常高，有望将体外诱导的胰岛β细胞应用于临床。诱导的胰岛β细胞应用于临床。

【技术实现步骤摘要】
一种诱导间充质干细胞向胰岛
β
细胞分化的方法


[0001]本专利技术涉及生物医学领域，具体涉及一种诱导间充质干细胞向胰岛β细胞分化的方法。

技术介绍

[0002]在糖尿病的自然病程中，胰岛β细胞功能的持续恶化是一个不可逆的过程。众所周知，胰岛素由胰岛β细胞产生，而无论是1型糖尿病或是2型糖尿病都存在胰岛β细胞的衰竭问题，区别仅仅在于前者发病时即表现为需要外源性胰岛素维持生存，而2型糖尿病的β细胞功能衰竭则发生在疾病的晚期。
[0003]因此，恢复胰岛β细胞功能一直是医学界和糖尿病患者追求的目标。目前人们寄希望于大量胰腺或胰岛β细胞移植来达到这一目标，细胞治疗为代表的糖尿病治疗替代策略被广泛研究。其中干细胞疗法是研究的重点领域之一，目前多集中于使用化学小分子诱导某种干细胞向特定体细胞分化。
[0004]细胞外囊泡EV包括凋亡小体，微囊泡(MV)，和外泌体(EXO)，富含蛋白质，DNA(基因组和线粒体)和RNA，特别是小的非编码RNA，包扩microRNA，小核RNA，金库RNA和Y RNA。由于EV装载过程中施加的高选择性，其中RNA代表了细胞RNA的严重偏向亚群。
[0005]间充质干细胞(MSC)是一种多能干细胞，来源方便，细胞数量充足，易于分离、培养、扩增和纯化，无伦理学问题，不会产生免疫排斥反应，且自身具有免疫调节功能。目前临床已经证实该细胞能够治疗心脑血管系统疾病，糖尿病，肝肾损伤，脑及脊髓神经损伤等疾病。胎盘来源MSC是一种实用的组织修复种子细胞。
[0006]在糖尿病长期治疗过程中，需要大量胰腺或胰岛β细胞移植，这远远超过供给量，而且费用高昂，存在移植物排异反应等难题；使用化学小分子诱导某种干细胞向特定体细胞诱导分化这种传统的干细胞疗法步骤普遍繁琐，诱导时间大多超过20天，且其中很多化学小分子都有毒性，对人体应用的影响未知；目前细胞外囊泡(EV)用于诱导分化效率很低，仍是使用大量化学小分子完成诱导，EV用于诱导处于探索阶段，还不能满足临床需要。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的是提供一种诱导间充质干细胞向胰岛β细胞分化的方法。本专利技术成功实现了单用微囊泡(MV)将干细胞诱导分化为胰岛β细胞。本专利技术实现了通过MV发挥主导作用，诱导干细胞分化为胰岛β细胞。
[0008]第一方面，本专利技术提供一种诱导干细胞分化为胰岛β细胞的方法，所述方法包括：预诱导和正式诱导；所述预诱导中MV工作浓度为35
‑
40μg/mL，所述正式诱导中，MV工作浓度为70
‑
80μg/mL；烟酰胺工作浓度为5
‑
10mM、胰岛素转铁蛋白
‑
硒工作浓度为0.5
‑
1％。
[0009]本专利技术提供的诱导方法的示意图，如图1所示。
[0010]在本专利技术提供的方法中，为了保证良好的诱导效率，干细胞培养体系中，采用无EV的血清。
[0011]本专利技术所述MV的粒径范围为50nm
‑
500nm；所述MV为具胰岛β细胞功能的细胞所产生的MV。
[0012]在本专利技术提供的方法中，所述MV来自大鼠胰岛素瘤细胞(INS
‑
1)，大鼠胰岛素瘤细胞(INS
‑
1)培养体系中，采用无EV的血清；分离得到MV的粒径范围为50nm
‑
500nm。本专利技术应用的INS
‑
1是目前公认的研究糖尿病以及胰岛β细胞的模式细胞，其他物种比如人、小鼠、牛、马、猪等等的胰岛β细胞产生的EV、EXO和MV，也在本专利技术保护之中。
[0013]在本专利技术提供的方法中，预诱导的诱导时间为2
‑
4天；正式诱导的诱导时间为15
‑
18天。
[0014]在本专利技术提供的方法中，所述干细胞为间充质干细胞。
[0015]在本专利技术提供的方法中，将间充质干细胞铺板后，待细胞汇合20％
‑
40％时，加入MV工作浓度为35
‑
40μg/mL的第一培养体系；培养2
‑
4天，加入MV工作浓度为70
‑
80μg/mL的第二培养体系；
[0016]优选地，所述第二培养体系中还含有工作浓度为8
‑
10mM的烟酰胺和工作浓度为0.8
‑
1％的胰岛素转铁蛋白
‑
硒。
[0017]在本专利技术提供的方法中，在获得MV时，所用方法如下：培养大鼠胰岛素瘤细胞(INS
‑
1)，每36
‑
48h收集一次培养基，300
‑
2000g离心去除死细胞和细胞碎片，12000g超速离心去除上清获得沉淀，用PBS重悬沉淀，将沉淀定量到150
‑
190μg/mL，4℃保存备用。
[0018]第二方面，本专利技术提供一种诱导干细胞分化为胰岛β细胞的诱导剂，所述诱导剂为具有胰岛β细胞功能的细胞所产生的微囊泡、胰岛素转铁蛋白
‑
硒和烟酰胺。
[0019]第三方面，本专利技术提供一种诱导干细胞分化为胰岛β细胞的培养基，所述培养基中，含有具胰岛β细胞功能的细胞所产生的微囊泡、DMEM和8
‑
10％不含EV的血清、烟酰胺的工作浓度为5
‑
10mM、胰岛素转铁蛋白
‑
硒工作浓度为0.5
‑
1％；所述培养基中具胰岛β细胞功能的细胞所产生的微囊泡的工作浓度为35
‑
80μg/mL、粒径为50
‑
500nm。
[0020]根据本领域技术人员的理解，本专利技术还请求保护上述的诱导剂或上述的培养基在提高干细胞诱导分化为胰岛β细胞的诱导效率中的应用。
[0021]本专利技术的有益效果在于：
[0022]本专利技术提供的方法，可以更加高效和安全地获得胰岛β细胞，用于后期糖尿病治疗，以避免或解决胰腺或胰岛β细胞移植带来的供不应求、费用高昂，移植物排异反应等难题，并且，克服了传统的干细胞疗法存在步骤繁琐、诱导时间太长、化学小分子毒性等问题，以及目前EV用于诱导分化效率太低的问题。
[0023]本专利技术提供的方法可用于诱导取自糖尿病患者体内的MSC，或者诱导胎盘来源间充质干细胞这种组织修复种子细胞，在体外向胰岛β细胞分化，然后将诱导成功的胰岛β细胞移植到病人体内，不用依赖捐献或购买有限的异体胰腺或成体胰岛β细胞。这种方法使胰岛β细胞来源大大增加，甚至实现量产，使治疗费用大大降低，且没有了免疫排异反应。
[0024]由于本专利技术大幅提高了MV的诱导效率，使MV在胰岛β细胞诱导中真正的起到主导作用，实现了研究人员期望的EV介导细胞间通讯诱导分化这一新方式。与传统的干细胞疗法相比，本专利技术的诱导步骤简化到了只有预诱导与正式诱导2步。诱导时间缩短到18天。只用了少量的2个无毒且成本低廉的化学小分子，其中烟酰胺已证实对人体有诸多益处本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种诱导干细胞分化为胰岛β细胞的方法，其特征在于，所述方法包括：预诱导和正式诱导；所述预诱导中MV工作浓度为35
‑
40μg/mL，所述正式诱导中，MV工作浓度为70
‑
80μg/mL；烟酰胺工作浓度为5
‑
10mM、胰岛素转铁蛋白
‑
硒工作浓度为0.5
‑
1％。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，干细胞培养体系中，采用无EV的血清。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述MV的粒径范围为50nm
‑
500nm；所述MV为具胰岛β细胞功能的细胞所产生的MV。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，预诱导的诱导时间为2
‑
4天；正式诱导的诱导时间为15
‑
18天。5.根据权利要求1
‑
4任一项所述的方法，其特征在于，所述干细胞为间充质干细胞。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，包括：将间充质干细胞铺板后，待细胞汇合20％
‑
40％时，加入MV工作浓度为35
‑
40μg/mL的第一培养体系；培养2
‑
4天，加入MV工作浓度为70
‑
80μg/mL的第二培养体系；优选地，所述第二培养体系中还含有工作浓度...

【专利技术属性】
技术研发人员：于海佳，宁明明，刘英辉，
申请(专利权)人：南京师范大学，
类型：发明
国别省市：