一种高效的细胞系基因敲除方法技术

本发明专利技术公开了一种高效的细胞系基因敲除方法，涉及基因工程技术领域

【技术实现步骤摘要】
一种高效的细胞系基因敲除方法


[0001]本专利技术涉及基因工程
，尤其涉及一种高效的细胞系基因敲除方法
。

技术介绍

[0002]CRISPR/Cas9
基因编辑技术是第三代基因编辑技术，有着编辑效率高
、
操作简便
、
成本低的优势，是当今最主流的基因编辑系统
。
目前，该技术在模式动物领域的应用规模已经非常庞大，构建流程也基本实现了标准化
、
规范化，项目的成功率也较高
。CRISPR/Cas9
基因编辑技术在模式动物领域成功率高的原因主要在于以下两方面：一方面是由于模式动物使用的品系种类很少，操作流程基本一致，加上使用的基本都是近交品系
(
如
C57BL/6
和
BALB/c)
，遗传背景高度一致，基因编辑难度相对较低；另一方面，模式动物作为独立个体，对其进行基因敲除时，可以不用“一步到位”，即不需要一次编辑就获得纯合子，只需要获得带有敲除基因型的杂合
F0
，再通过与
WT(
野生型
)
杂交后自交就可以筛选到纯合个体
。
[0003]相对于模式动物领域，细胞系基因敲除则复杂得多，常用细胞系有上百种，不同细胞系特性差异较大，需要摸索最佳实验方法和积累参数，其中单克隆形成能力和制备方法尤为重要，是细胞基因敲除的技术瓶颈；另外细胞的核型也是影响成功率的关键因素，细胞系不能像小鼠一样先拿到杂合再交配，必须一次性筛到纯合，因此如果核型复杂
(
比如超三倍体
)
的细胞，基因编辑获得纯合的难度更大
。
[0004]现有技术在进行细胞系基因敲除时，存在以下几个问题：
[0005](1)
基因敲除效率较低，通常需要培养和鉴定上百个单克隆才能筛到纯合子；
[0006](2)
基因型鉴定可实施时间太晚，因为现有方法需要较多的细胞数量用于提取基因组，导致单克隆细胞需要从
96
孔传代至
48/24
孔再传代至6孔，方可获得足够的细胞，导致周期长
、
效率低和工作量大
。
[0007](3)
基因型鉴定策略有局限性，移码的
DNA
碱基变换
(
通常＜
10bp)
，需要通过测序来进行初筛，样本量大，测序成本高，看测序结果费时费力
。

技术实现思路

[0008]针对
技术介绍
提出的问题，本专利技术的目的在于提出一种高效的细胞系基因敲除方法，具有基因敲除效率高
、
周期短
、
测序费用低和读取测序结果简单的作用，解决了现有技术在进行细胞系基因敲除时，存在的基因敲除效率较低
、
周期长
、
测序成本高和看测序结果费时费力的问题
。
[0009]为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0010]一种高效的细胞系基因敲除方法，包括以下步骤：
[0011](1)
载体构建与质粒制备：载体构建与质粒制备依次包括
gRNA
引物合成
、PCR
扩增
、
骨架线性化
、
载体拼接反应
、
热激转化
、
菌落
PCR
鉴定和测序鉴定
、
质粒提取和测序
、
质粒大提八个步骤，制得敲除质粒；所述敲除质粒采用
YKO
‑
RP003
作为载体骨架，删除载体骨架中如
SEQ ID NO
：1所示的序列；在载体骨架的
CMV
启动子和标签之间加入
insert
序列，所述
insert
序列为：
tctgtttaactaga
；将双
gRNA
装在同一载体骨架，得到敲除质粒；
[0012](2)
细胞转染与药筛：将敲除质粒递送到待敲除细胞内进行转染，转染完成后进行药筛；
[0013](3)pool
基因编辑效率检测：使用单克隆鉴定试剂盒对步骤
(2)
收取的
pool
细胞进行裂解，裂解产物进行
PCR
扩增和测序，测序结果通过红棉基因型分析系统进行分析，获得
pool
细胞切割效率数值
、pool
细胞中包含的基因型以及各基因型的占比；
[0014](4)
制备单克隆：将药筛后的细胞制成单细胞悬液，接种至多孔板中，加入培养液，将细胞放入培养箱中静置培养；在培养过程中进行观察，标记并计数含有单克隆的孔以及成功存活的单克隆；
[0015](5)
单克隆基因型鉴定：使用单克隆鉴定试剂盒对步骤
(4)
得到的单克隆进行裂解，裂解产物进行
PCR
扩增，对扩增产物进行电泳检测，根据电泳条带进行初筛，将初筛阳性的克隆进行测序，测序结果通过红棉基因型分析系统进行分析，判断基因型是否符合敲除标准
。
[0016]进一步的，所述高效的细胞系基因敲除方法在步骤
(1)
载体构建与质粒制备之前，还包括项目难度评估步骤，所述项目难度评估步骤包括基因评估
(
基因评估包括基因致死性评估和基因表达量评估
)、
基因打靶方案设计和细胞预实验与难度评估
。
[0017]进一步的，结合红棉基因风险评估系统和表达量评估系统，确定待敲除基因是否具有致死风险及在目的细胞系中表达情况，若评估通过，则正常进行方案设计；
[0018]所述基因打靶方案设计的方法如下：在红棉
crispr
基因编辑系统进行敲除方案设计，筛选出敲除片段大小为
50
～
500bp
的
gRNA
；
[0019]所述细胞预实验与难度评估为通过进行预实验，了解待敲除细胞的倍增时间
、
传代比例
、
最佳转染方法
、
转染效率
、
药物耐受情况
、
药物筛选浓度
、
单克隆增殖能力以及最佳铺板梯度；当转染效率和单克隆增殖能力符合要求时，则项目可以正常进行，否则需要更换细胞或调整目标产物
。
[0020]进一步的，在所述步骤
(1)
中，
gRNA
引物合成的方法如下：靶序列的第一个碱基为
G
，在靶序列头部添加额外的碱基，正向引物头部添加
CACC
，反向引物头部添加
AAAC
，得到引物
F
和引物
R
；
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种高效的细胞系基因敲除方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)
载体构建与质粒制备：载体构建与质粒制备依次包括
gRNA
引物合成
、PCR
扩增
、
骨架线性化
、
载体拼接反应
、
热激转化
、
菌落
PCR
鉴定和测序鉴定
、
质粒提取和测序
、
质粒大提八个步骤，制得敲除质粒；所述敲除质粒采用
YKO
‑
RP003
作为载体骨架，在载体骨架的
CMV
启动子和标签之间加入
insert
序列，将双
gRNA
装在同一载体骨架，得到敲除质粒；
(2)
细胞转染与药筛：将敲除质粒递送到待敲除细胞内进行转染，转染完成后进行药筛；
(3)pool
基因编辑效率检测：使用单克隆鉴定试剂盒对步骤
(2)
药筛后的细胞进行裂解，裂解产物进行
PCR
扩增和测序，测序结果通过红棉基因型分析系统进行分析，获得
pool
细胞切割效率数值
、pool
细胞中包含的基因型以及各基因型的占比；
(4)
制备单克隆：将药筛后的细胞制成单细胞悬液，接种至多孔板中，加入培养液，将细胞放入培养箱中静置培养；在培养过程中进行观察，标记并计数含有单克隆的孔以及成功存活的单克隆；
(5)
单克隆基因型鉴定：使用单克隆鉴定试剂盒对步骤
(4)
得到的单克隆进行裂解，裂解产物进行
PCR
扩增，对扩增产物进行电泳检测，根据电泳条带进行初筛，将初筛阳性的克隆进行测序，测序结果通过红棉基因型分析系统分析，判断基因型是否符合敲除标准
。2.
根据权利要求1所述高效的细胞系基因敲除方法，其特征在于，在载体骨架
YKO
‑
RP003
中删除如
SEQ ID NO
：1所示的序列
。3.
根据权利要求1所述高效的细胞系基因敲除方法，其特征在于，所述
insert
序列为：
tctgtttaactaga。4.
根据权利要求1所述高效的细胞系基因敲除方法，其特征在于，所述高效的细胞系基因敲除方法在步骤
(1)
载体构建与质粒制备之前，还包括项目难度评估步骤，所述项目难度评估步骤包括基因评估
、
基因打靶方案设计和细胞预实验与难度评估
。5.
根据权利要求4所述高效的细胞系基因敲除方法，其特征在于，所述基因评估的操作流程如下：结合红棉基因风险评估系统和表达量评估系统，确定待敲除基因是否具有致死风险
、
在目的细胞系中的表达情况，若评估通过，则正常进行方案设计；所述基因打靶方案设计的方法如下：在红棉
crispr
基因编辑系统进行敲除方案设计，筛选出敲除片段大小为
50
～
500bp
的
gRNA
；所述细胞预实验与难度评估为通过进行预实验，了解待敲除细胞的倍增时间
、
传代比例
、
最佳转染方法
、
转染效率
、
药物耐受情况
、
药物筛选浓度
、
单克隆增殖能力以及最佳铺板梯度；当转染效率和单克隆增殖能力符合要求时，则项目可以正常进行，否则需要更换细胞或调整目标产物
。6.
根据权利要求4所述高效的细胞系基因敲除方法，其特征在于，所述步骤
(3)pool
基因编辑效率检测的操作方法如下：使用...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄秋凤，郑虹，郑丹丹，何英幸，
申请(专利权)人：广州源井生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：