一种提高MDA-MB-231单细胞克隆形成率的单克隆增强培养基与培养方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种提高MDA

【技术实现步骤摘要】
一种提高MDA
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231单细胞克隆形成率的单克隆增强培养基与培养方法及其应用


[0001]本专利技术涉及生物医学
，尤其涉及MDA
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231单细胞克隆的制备技术。

技术介绍

[0002]MDA
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231细胞是分离自一名51岁的女性乳腺癌患者的胸水的人乳腺癌细胞。MDA
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231是具有高度侵入性和分化程度低的三阴性乳腺癌 (TNBC)细胞系，三阴性指缺乏雌激素受体(ER)和雌激素受体(PR)表达，以及HER2(人类表皮生长因子受体2)过表达。与其他侵入性癌细胞系类似， MDA
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231细胞的侵入性通过细胞外基质的蛋白质降解进行调解。
[0003]MDA
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231被广泛用于三阴性乳腺癌的相关研究。通过ZFN、TALEN、 CRISPR/Cas9技术进行基因编辑，从而建立基因敲除、敲入、点突变等细胞株是常用的研究手段。然而，MDA
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231细胞在进行基因编辑的必经环节—单细胞克隆培养实验时，单细胞克隆形成率以及单细胞克隆培养状态都是不太理想，需要铺大量的板，才能筛到足够的克隆数进行鉴定。依照ATCC等权威细胞库的培养条件，MDA
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231细胞在含10％胎牛血清(FBS)的Leibovitz
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15 培养基、37℃、空气环境中进行贴壁培养，这一环境区别于绝大多数细胞的环境条件(37℃、5％CO2),需要配备专用培养箱单独进行培养，在成本及管理操作上都没有优势，更重要的是，这个培养条件虽然可以对MDA
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231细胞系进行常规培养，如复苏、传代、冻存等，但是对于MDA
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231极限稀释或分选后获得的单细胞克隆培养，单细胞克隆形成效率较低，制约基因编辑细胞株的制备效率。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种提高MDA
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231单细胞克隆形成率的单克隆增强培养基与培养方法及其应用，以解决现有技术中MDA
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231细胞培养成本高，以及因单细胞克隆形成效率低而制约基因编辑细胞株的制备问题。
[0005]为了达到上述目的本专利技术采用如下技术方案：
[0006]一种提高MDA
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231单细胞克隆形成率的单克隆增强培养基，所述单克隆增强培养基成分包括基础培养基、胎牛血清、非必需氨基酸；
[0007]所述基础培养基是由Leibovitz
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15培养基和DMEM培养基混合所得，或是由Leibovitz
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15培养基和RPMI
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1640培养基混合所得。
[0008]进一步地，所述单克隆增强培养基成分还包括氢化可的松和/或抗坏血酸。
[0009]进一步地，所述基础培养基是由Leibovitz
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15培养基和DMEM培养基按体积比1：1混合所得，或是由Leibovitz
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15培养基和RPMI
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1640培养基按体积比1：1混合所得。
[0010]进一步地，所述基础培养基、胎牛血清的体积比是90：10。
[0011]进一步地，所述非必需氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸、丝氨酸，甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸、丝氨酸的终浓度均
为100μM。
[0012]进一步地，所述氢化可的松的浓度范围为0.5～1μg/ml，抗坏血酸的浓度范围为30～50μg/ml。
[0013]一种应用所述单克隆增强培养基的MDA
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231单细胞克隆培养方法，步骤包括：将MDA
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231细胞加入到培养板中进行单细胞克隆培养，以开始培养单细胞克隆为时间点0h，0h至24h间在含10％胎牛血清的Leibovitz
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15 培养基、37℃、空气环境中进行贴壁培养，24h至48h间更换为单克隆增强培养基，在37℃和5％CO2的环境下培养，每5d更换新鲜单克隆增强培养基，直至形成可传代的单细胞克隆。
[0014]更优地，步骤包括：将MDA
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231细胞消化成单细胞悬液后，以有限稀释法将单细胞悬液逐级稀释至浓度为1个细胞/100μL的细胞悬液，然后将稀释后的细胞悬液按100μL每孔加入到96孔细胞培养板中进行单细胞克隆培养，以开始培养单细胞克隆为时间点0h，0h至24h间在含10％胎牛血清的Leibovitz
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15培养基、37℃、空气环境中进行贴壁培养，24h至48h间更换为单克隆增强培养基，在37℃和5％CO2的环境下培养，每5d更换新鲜单克隆增强培养基，直至形成可传代的单细胞克隆。
[0015]本专利技术还提供一种所述培养方法得到的MDA
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231单细胞克隆在研究三阴性乳腺癌或基因编辑中的应用。
[0016]本专利技术还提供一种所述培养方法得到的MDA
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231单细胞克隆在筛选抗肿瘤药物中的应用。
[0017]本专利技术的优点包括：
[0018]1.本专利技术的培养基适用5％CO2的常规培养环境，不需要配备专用培养箱，在成本和管理操作上具有优势，在管理及操作上大大提升效率；
[0019]2.本专利技术的MDA
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231单细胞克隆形成效率高，单细胞克隆生长状态好，容易获得足够的单细胞克隆进行基因型鉴定，大大提高基因编辑细胞株的制备效率。
附图说明
[0020]此处所说明的附图用来提供对本专利技术的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本专利技术的不当限定，在附图中：
[0021]图1A是实施例一对照组采用ATCC培养方法培养7d的MDA
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231细胞的单细胞克隆形态实验图；B是实施例二采用单克隆增强培养基B4培养7d的单细胞克隆形态实验图。
具体实施方式
[0022]下面将结合附图以及具体实施例来详细说明本专利技术，在此以本专利技术的示意性实施例及说明用来解释本专利技术，但并不作为对本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提高MDA
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231单细胞克隆形成率的单克隆增强培养基，其特征在于：所述单克隆增强培养基成分包括基础培养基、胎牛血清、非必需氨基酸；所述基础培养基是由Leibovitz
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15培养基和DMEM培养基混合所得，或是由Leibovitz
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15培养基和RPMI
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1640培养基混合所得。2.根据权利要求1所述的一种提高MDA
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231单细胞克隆形成率的单克隆增强培养基，其特征在于：所述单克隆增强培养基成分还包括氢化可的松和/或抗坏血酸。3.根据权利要求1或2所述的一种提高MDA
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231单细胞克隆形成率的单克隆增强培养基，其特征在于：所述基础培养基是由Leibovitz
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15培养基和DMEM培养基按体积比1：1混合所得，或是由Leibovitz
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15培养基和RPMI
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1640培养基按体积比1：1混合所得。4.根据权利要求1或2所述的一种提高MDA
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231单细胞克隆形成率的单克隆增强培养基，其特征在于：所述基础培养基、胎牛血清的体积比是90：10。5.根据权利要求1或2所述的一种提高MDA
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231单细胞克隆形成率的单克隆增强培养基，其特征在于：所述非必需氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸、丝氨酸，甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸、丝氨酸的终浓度均为100μM。6.根据权利要求2所述的一种提高MDA
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231单细...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑虹，李淼兰，何英幸，
申请(专利权)人：广州源井生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：