一种培养复发膀胱癌活检样本类器官的培养基及其培养方法技术

本发明专利技术公开了一种复发性膀胱癌类器官的培养基及其培养方法。通过调整培养基中各种组分的含量，能够实现对高异质性复发膀胱癌进行类器官培养，提高了类器官培养成功率，为筛选特定的抗癌药物奠定了基础。特定的抗癌药物奠定了基础。特定的抗癌药物奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】
一种培养复发膀胱癌活检样本类器官的培养基及其培养方法


[0001]本专利技术涉及细胞培养领域，具体的涉及一种复发性膀胱癌类器官的培养基及其培养方法。

技术介绍

[0002]膀胱癌是影响人类健康和生存，加重居民经济负担的重要瘤种。目前膀胱癌新发病例数全球每年约57万余例，位居所有肿瘤第12位；全球每年因膀胱癌致死病例数约21万余例，位居所有肿瘤第14位。经过各种手段综合治疗后的膀胱癌患者5年生存率高达77％，其中膀胱原位癌、局部、区域和远处转移患者的5年生存率分别为96％，69％，37％和6％。影响膀胱癌患者生存和预后的最重要因素是初次治疗后的肿瘤复发，膀胱癌的复发与初诊肿瘤分期有关：原位癌或非浸润性癌的5年复发率约为65％，进展期患者复发率高达73％。膀胱癌复发后的治疗相较初诊时难度增加较大，且往往治疗效果欠佳。
[0003]如何进一步改善复发性膀胱癌的治疗效果是膀胱癌治疗领域的重点和难点，其中肿瘤个体化治疗(精准治疗)是重要的潜在方向。肿瘤类器官作为新兴的肿瘤体外模型，有望为复发性膀胱癌精准治疗提供可靠帮助。
[0004]肿瘤类器官(tumor organoid)则一般是指由肿瘤患者肿瘤组织体外培养而来的类器官。肿瘤类器官能在病理形态、基因变异、染色体稳定性和肿瘤异质性等方面忠实模拟对应患者体内肿瘤，因此肿瘤类器官是指导肿瘤精准治疗的绝佳工具。目前原发膀胱癌类器官培养体系已成功建立，美国哥伦比亚大学医学中心的Suk Hyung Lee等成功培养原发膀胱癌类器官并证明其是模拟肿瘤进化和预测药物疗效的可靠工具。然而迄今为止原发膀胱癌类器官的培养成功率尚且不高，培养经验最丰富的研究者成功率可达70％左右，一般技术人员的成功率只有30％左右。导致培养成功率较低的原因很多，培养基缺陷是其中最关键的原因。
[0005]复发性肿瘤的肿瘤类器官培养难度较原发肿瘤更大，若采用原发肿瘤类器官培养基培养成功率极低，这是类器官学术界和产业界共识性难题。因此复发性膀胱癌的肿瘤类器官培养是一大挑战，目前尚未见到相关成功研究被报道。这对肿瘤类器官指导复发性膀胱癌精准治疗造成明显障碍。
[0006]本专利技术要解决的技术问题是在充分了解复发性膀胱癌分子生物学和以往丰富的类器官培养经验基础上，开发了针对复发性膀胱癌高度异质性的多种不同组分培养基，解决了复发性膀胱癌肿瘤类器官的培养成功率低下的难题，为肿瘤类器官用于指导复发性膀胱癌精准治疗打下了坚实基础。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于，提供一种适宜复发性膀胱癌类器官培养的培养基及其培养方法，进而获得复发性膀胱癌类器官，以便为复发性膀胱癌的病程发展以及抗癌药物的筛选提供有利条件。
[0008]为解决上述技术问题，本专利技术提供一种复发性膀胱癌的类器官培养基，所述培养基成分包括如下成分：
[0009]高糖DMEM培养基，F12K培养基，抗坏血酸，L
‑
谷氨酸，亚硒酸钠，乙醇胺盐酸盐，偏钒酸铵，四水合氯化锰，N2，B27，谷氨酰胺补剂，HEPES，烟酰胺，Normocin
TM
，N
‑
乙酰半胱氨酸，R
‑
spondin 1，Noggin。
[0010]优选的，所述培养基中高糖DMEM培养基和F12K培养基的比例为1
‑
2:1。
[0011]优选的，所述培养基中L
‑
谷氨酸的浓度为1
‑
100mg/L。
[0012]优选的，所述培养基中亚硒酸钠的浓度为0.002
‑
0.5mg/L。
[0013]优选的，所述培养基中乙醇胺盐酸盐的浓度为2
‑
200mg/L。
[0014]优选的，所述培养基中偏钒酸铵的浓度为1
×
10
‑4‑
20
×
10
‑4mg/L。
[0015]优选的，所述培养基中四水合氯化锰的浓度为5
×
10
‑5‑
50
×
10
‑5mg/L。
[0016]优选的，所述培养基中R
‑
spondin 1的浓度为50
‑
1000ng/ml。
[0017]优选的，所述培养基中Noggin的浓度为10
‑
200ng/ml。
[0018]优选的，所述培养基中N2：B27的规格为0.1
‑
2。
[0019]优选的，所述培养基中谷氨酰胺补剂规格为1
×
。
[0020]优选的，所述培养基中HEPES的规格为1
×
。
[0021]优选的，所述培养基中Normocin
TM
的规格为1
×
。
[0022]优选的，所述培养基中烟酰胺的浓度为1
‑
100mM。
[0023]优选的，所述培养基中N
‑
乙酰半胱氨酸的浓度为0.1
‑
10mM。
[0024]优选的，所述培养基中还包括A83
‑
01，进一步优选的，所述A83
‑
01浓度为0.1
‑
50μM。
[0025]优选的，所述培养基中还包括HGF，进一步优选的，所述HGF浓度为5
‑
500ng/ml。
[0026]优选的，所述培养基中还包括CHIR99021，进一步优选的，所述CHIR99021浓度为1
‑
100μM。
[0027]优选的，所述培养基中还包括DMSO，进一步优选的，所述DMSO浓度为培养基体积比的0.01
‑
2％。
[0028]本专利技术另一方面，提供了一种培养基培养复发性膀胱癌细胞获得膀胱癌类器官的培养方法，包括使用上述培养基以及优选的组分选择性的添加，能够对多种的复发性膀胱癌实现类器官培养。
[0029]具体的，所述方法如下：
[0030]1.获得临床复发膀胱癌活检样本(直径3
‑
5mm)，4℃保存于专用保存液中，24小时内低温转移至操作室；
[0031]2.样本冰PBS清洗3
‑
5次，低温切成1mm碎片，酶解消化；
[0032]3.样本消化完全后，添加与消化液同体积的冰PBS，反复吹打直至不见碎片组织，细胞筛网过滤；
[0033]4.低温离心去除上清，冰浴加入红细胞裂解液去除红细胞；
[0034]5.待裂解操作完成后，低温离心去除上清，冰PBS重悬，重复3
‑
5次；
[0035]6.低温离心去除上清，依据获得细胞情况，1
‑
5ml冰PBS重悬后显微镜下计数细胞；
[0036]7.低温离心去除上清，依据细胞计数加入适量冰Matrigel重悬接种于24孔板，加
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种复发性膀胱癌类器官培养基，其特征在于，所述培养基包含如下组分：高糖DMEM/F12K培养基1
‑
2:1，抗坏血酸1
‑
100mg/L，L
‑
谷氨酸1
‑
100mg/L，亚硒酸钠0.002
‑
0.5mg/L，乙醇胺盐酸盐2
‑
200mg/L，偏钒酸铵1
×
10
‑4‑
20
×
10
‑4mg/L，四水合氯化锰5
×
10
‑5‑
50
×
10
‑5mg/L、R
‑
spondin1 50
‑
1000ng/ml，Noggin 10
‑
200ng/ml，N2：B27(0.1
‑
2)，谷氨酰胺补剂(1
×
)，HEPES(1
×
)，烟酰胺1
‑
100mM，Normocin
TM
(1
×
)，N
‑
乙酰半胱氨酸0.1
‑
10mM。2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述培养基还包括以下物质的一种或多种：A83
‑
01，EGF，FGF10，肝素；HGF，DMSO，CHIR99021。3.根据前述任一权利要求所述的培养基，其特征在于所述培养基中包括添加物的组合为A83
‑
01，EGF，FGF10，肝素或HGF，DMSO，CHIR99021。4.根据权利要求2
‑
3任一所述的培养基，其特征在于，所述A83
‑
01浓度为0.1
‑

【专利技术属性】
技术研发人员：柏卫华，
申请(专利权)人：柏卫华，
类型：发明
国别省市：