无血清悬浮型LMH细胞系及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供一种无血清悬浮型LMH细胞系及其制备方法和应用。本发明专利技术采用添加氨基酸、维生素、无机盐、微量元素以及其他成分的DMEM/F12培养基的无血清培养基配方制备无血清悬浮型LMH细胞系，该无血清培养基配方能够用于贴壁培养型LMH细胞传代培养，经过逐代传代培养使其能适应采用该无血清培养基配方进行悬浮培养的方式，有助于LMH细胞的规模化生产，有利于病毒的复制和表达，促进病毒疫苗的规模化生产。产。产。

【技术实现步骤摘要】
无血清悬浮型LMH细胞系及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种无血清悬浮型LMH细胞系及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]鸡肝癌细胞(LMH细胞)已成为生产禽类腺病毒(Fowl Adenovirus，FADV)、鸡传染性喉气管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus,ILTV)等常用的细胞系之一。贴壁型LMH细胞在培养过程中，贴壁困难，易聚团生长，通常需使用含10％(v/v)及以上的胎牛血清的培养基进行培养，且由于转瓶、细胞工厂等贴壁细胞培养容器的限制，生产成本一直居高不下，致使用该细胞系生产的产品无法规模化放大。另外，采用含血清成分的培养基对贴壁型LMH细胞培养的过程中，血清化学成分不确定，且批次间质量不稳定，以致于用此种细胞生产的生物制品，质量难以控制。
[0003]相对于采用含血清培养基进行贴壁培养而言，采用无血清培养基进行悬浮培养的工艺，其培养基成分明确，可大规模培养，占地面积小，单位体积能生产更多的生物制品，从而提高产能，降低成本。随着高密度细胞培养容器的推广及生物制品质量安全标准的提高，可悬浮的细胞具有了更广泛的应用前景。然而，目前适用于无血清悬浮培养工艺的LMH细胞及无血清培养基鲜有报道。

技术实现思路

[0004]基于上述技术问题，本专利技术的目的之一是提供一种无血清悬浮培养型LMH细胞系的制备方法，采用该制备方法，能获得生长状态稳定、分散性好的悬浮培养型LMH细胞，适用于LMH细胞以及病毒的规模化培养。
[0005]本专利技术的目的可以通过以下技术方案实现：
[0006]一种无血清悬浮培养型LMH细胞系的制备方法，所述制备方法包括采用无血清培养基对贴壁培养型LMH细胞进行传代培养制备无血清悬浮培养型LMH细胞系的步骤；
[0007]所述无血清培养基包含氨基酸、维生素、盐、微量元素、葡萄糖、β
‑
巯基乙醇、重组人胰岛素和Pluronic F
‑
68，以及DMEM/F12培养基。
[0008]在其中一些实施例中，所述氨基酸选自L
‑
丙氨酸、L
‑
精氨酸盐酸盐、L
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谷氨酸、L
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谷氨酰胺、甘氨酸、L
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组氨酸盐酸盐水合物、L
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异亮氨酸、L
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亮氨酸、L
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丝氨酸、L
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苏氨酸、天冬酰胺一水合物、天冬氨酸、L
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半胱氨酸一水合物、L
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赖氨酸盐酸盐、甲硫氨酸、L
‑
苯丙氨酸、L
‑
脯氨酸、L
‑
色氨酸和L
‑
缬氨酸中的一种或者多种。
[0009]在其中一些实施例中，所述维生素选自泛酸钙、氯化胆碱、生物素、对氨基苯甲酸、抗坏血酸和生育酚中的一种或者多种。
[0010]在其中一些实施例中，所述盐选自氯化钠、无水硫酸镁、氯化钾、碳酸氢钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和丙酮酸钠中的一种或者多种；
[0011]在其中一些实施例中，所述微量元素选自亚硒酸钠、四水合钼酸铵和七水硫酸锌
中的一种或者多种。
[0012]在其中一些实施例中，所述无血清培养基包含DMEM/F12培养基以及如下浓度的组分：L
‑
丙氨酸133mg/L
‑
1680mg/L、L
‑
精氨酸盐酸盐60mg/L
‑
1525mg/L、L
‑
谷氨酸25mg/L
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1375mg/L、L
‑
谷氨酰胺150mg/L
‑
1300mg/L、甘氨酸5mg/L
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1300mg/L、L
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组氨酸盐酸盐水合物60mg/L
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1525mg/L、L
‑
异亮氨酸20mg/L
‑
1466mg/L、L
‑
亮氨酸30mg/L
‑
1400mg/L、L
‑
丝氨酸110mg/L
‑
1428mg/L、L
‑
苏氨酸60mg/L
‑
1417mg/L、天冬酰胺一水合物80mg/L
‑
1390mg/L、天冬氨酸50mg/L
‑
1359mg/L、L
‑
半胱氨酸一水合物150mg/L
‑
1352mg/L、L
‑
赖氨酸盐酸盐90mg/L
‑
1333mg/L、甲硫氨酸50mg/L
‑
1346mg/L、L
‑
苯丙氨酸20mg/L
‑
1296mg/L、L
‑
脯氨酸27mg/L
‑
1261mg/L、L
‑
色氨酸40mg/L
‑
1500mg/L、L
‑
缬氨酸58mg/L
‑
1394mg/L、泛酸钙1.0mg/L
‑
50mg/L、氯化胆碱0.5mg/L
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5mg/L、生物素0.05mg/L
‑
0.9mg/L、对氨基苯甲酸0.02mg/L
‑
0.2mg/L、抗坏血酸0.01mg/L
‑
0.5mg/L、生育酚0.05mg/L
‑
0.95mg/L、氯化钠2200mg/L
‑
7500mg/L、无水硫酸镁300mg/L
‑
1800mg/L、氯化钾100mg/L
‑
790mg/L、碳酸氢钠1600mg/L
‑
4200mg/L、磷酸二氢钠129mg/L
‑
1300mg/L、磷酸氢二钠68mg/L
‑
744mg/L、亚硒酸钠1.7mg/L
‑
6mg/L、四水合钼酸铵0.5mg/L
‑
2mg/L、七水硫酸锌0.6mg/L
‑
4.1mg/L、葡萄糖2000mg/L
‑
8000mg/L、β
‑
巯基乙醇0.4mg/L
‑
25mg/L、丙酮酸钠200mg/L
‑
800mg/L、重组人胰岛素2mg/L
‑
10mg/L，和Pluronic F
‑
68 500mg/L
‑
2400mg/L。
[0013]在其中一些实施例中，所述无血清培养基包含DMEM/F12培养基以及如下浓度的组分：L
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丙氨酸400mg/L
‑
500mg/L、L
‑
精氨酸盐酸盐120mg/L
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种无血清悬浮培养型LMH细胞系的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括采用无血清培养基对贴壁培养型LMH细胞进行传代培养制备无血清悬浮培养型LMH细胞系的步骤；所述无血清培养基包含氨基酸、维生素、盐、微量元素、葡萄糖、β
‑
巯基乙醇、重组人胰岛素和Pluronic F
‑
68，以及DMEM/F12培养基。2.根据权利要求1所述的无血清悬浮培养型LMH细胞系的制备方法，其特征在于，所述氨基酸选自L
‑
丙氨酸、L
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精氨酸盐酸盐、L
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谷氨酸、L
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谷氨酰胺、甘氨酸、L
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组氨酸盐酸盐水合物、L
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异亮氨酸、L
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亮氨酸、L
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丝氨酸、L
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苏氨酸、天冬酰胺一水合物、天冬氨酸、L
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半胱氨酸一水合物、L
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赖氨酸盐酸盐、甲硫氨酸、L
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苯丙氨酸、L
‑
脯氨酸、L
‑
色氨酸和L
‑
缬氨酸中的一种或者多种；或/和，所述维生素选自泛酸钙、氯化胆碱、生物素、对氨基苯甲酸、抗坏血酸和生育酚中的一种或者多种；或/和，所述盐选自氯化钠、无水硫酸镁、氯化钾、碳酸氢钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和丙酮酸钠中的一种或者多种；或/和，所述微量元素选自亚硒酸钠、四水合钼酸铵和七水硫酸锌中的一种或者多种。3.根据权利要求2所述的无血清悬浮培养型LMH细胞系的制备方法，其特征在于，所述无血清培养基包含DMEM/F12培养基以及如下浓度的组分：L
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丙氨酸133mg/L
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1680mg/L、L
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精氨酸盐酸盐60mg/L
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1525mg/L、L
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谷氨酸25mg/L
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1375mg/L、L
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谷氨酰胺150mg/L
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1300mg/L、甘氨酸5mg/L
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1300mg/L、L
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组氨酸盐酸盐水合物60mg/L
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1525mg/L、L
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异亮氨酸20mg/L
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1466mg/L、L
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亮氨酸30mg/L
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1400mg/L、L
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丝氨酸110mg/L
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1428mg/L、L
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苏氨酸60mg/L
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1417mg/L、天冬酰胺一水合物80mg/L
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1390mg/L、天冬氨酸50mg/L
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1359mg/L、L
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半胱氨酸一水合物150mg/L
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1352mg/L、L
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赖氨酸盐酸盐90mg/L
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1333mg/L、甲硫氨酸50mg/L
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1346mg/L、L
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苯丙氨酸20mg/L
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1296mg/L、L
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脯氨酸27mg/L
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1261mg/L、L
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色氨酸40mg/L
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1500mg/L、L
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缬氨酸58mg/L
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1394mg/L、泛酸钙1.0mg/L
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50mg/L、氯化胆碱0.5mg/L
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5mg/L、生物素0.05mg/L
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0.9mg/L、对氨基苯甲酸0.02mg/L
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0.2mg/L、抗坏血酸0.01mg/L
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0.5mg/L、生育酚0.05mg/L
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0.95mg/L、氯化钠2200mg/L
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7500mg/L、无水硫酸镁300mg/L
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1800mg/L、氯化钾100mg/L
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790mg/L、碳酸氢钠1600mg/L
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4200mg/L、磷酸二氢钠129mg/L
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1300mg/L、磷酸氢二钠68mg/L
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744mg/L、亚硒酸钠1.7mg/L
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6mg/L、四水合钼酸铵0.5mg/L
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2mg/L、七水硫酸锌0.6mg/L
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4.1mg/L、葡萄糖2000mg/L
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8000mg/L、β
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巯基乙醇0.4mg/L
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25mg/L、丙酮酸钠200mg/L
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800mg/L、重组人胰岛素2mg/L
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10mg/L，和Pluronic F
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68 500mg/L
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2400mg/L；可选地，所述无血清培养基包含DMEM/F12培养基以及如下浓度的组分：L
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丙氨酸400mg/L
‑
500mg/L、...

【专利技术属性】
技术研发人员：王嘉琪，钱建宁，牛盛蕃，李鹏杰，张业炘，魏喜红，苏泽山，张瑶，
申请(专利权)人：澳斯康生物南通股份有限公司甘肃健顺生物科技有限公司健顺生物科技南通有限公司，
类型：发明
国别省市：