纳米抗体的层析方法技术

本发明专利技术涉及一种纳米抗体的层析方法，包括如下步骤：S1：对纳米抗体收获液进行亲和层析，收集亲和层析洗脱液；S2：调节所述亲和层析洗脱液的pH为5

【技术实现步骤摘要】
纳米抗体的层析方法


[0001]本专利技术涉及抗体纯化
，特别是涉及一种纳米抗体的层析方法。

技术介绍

[0002]抗体（Antibody）是一种由机体免疫系统针对外源物质（如细菌、病毒的蛋白）所产生的一种球状蛋白质，因此又被称为免疫球蛋白（Ig）。近年来，随着抗体药物不断应用于更多治疗领域，抗体药物的结构也变得更为多样化。其中，纳米抗体（nanobodies，Nbs）因具有较小的相对分子质量，相比较传统的单克隆抗体具有独特的优势，包括免疫原性相对较弱、组织渗透性增强等，其独特的分子结构也使其适用于疾病诊断治疗等诸多领域。
[0003]抗体在应用时通常均需要经过层析纯化。针对传统的单克隆抗体的层析方法可如：有方法应用疏水相互作用层析联用层析纯化抗体分子蛋白，该过程可顺序包括蛋白A亲合层析、离子交换层析和疏水相互作用层析的步骤。该方法能够去除并回收抗体中的无免疫球蛋白聚集、错误折叠种类以及宿主细胞蛋白（HCP）和蛋白A的单体IgG抗体。
[0004]还有方法提供了一种人胰高血糖素样肽
‑
1（hGLP
‑
1）类似物融合蛋白（包括度拉鲁肽）的纯化方法，包括采用三步层析法进行纯化：所述样品先经粗纯步骤Protein A亲和层析，以有效去除HCP、内毒素等杂质且维持较高的目的蛋白收率；然后再使用阴离子交换层析和疏水层析来进一步精细纯化，以有效去除所述样品中的电荷异构体、残留的HCP和其它痕量杂质，并将各杂质含量控制在用药安全范围以内，且维持较高的目的蛋白收率和活性。r/>[0005]但是，目前纳米抗体的分子设计并不是十分成熟，与传统的单克隆抗体相比，纳米抗体存在稳定性差、易聚集的问题，且产生的聚集体以及如HCP、宿主细胞DNA（HCD）等杂质更难通过传统的层析方法去除。

技术实现思路

[0006]基于此，本专利技术提供一种能够有效去除聚集体、宿主细胞蛋白（HCP）和宿主细胞DNA（HCD）的纳米抗体的层析方法。
[0007]具体地技术方案如下：本专利技术提供一种纳米抗体的层析方法，包括如下步骤：S1：对纳米抗体收获液进行亲和层析，收集亲和层析洗脱液；S2：调节所述亲和层析洗脱液的pH为5
±
0.5、纳米抗体浓度≤6mg/mL，然后加入(NH4)2SO4调节电导率至80
±
20mS/cm，制备待层析液；S3：对所述待层析液进行疏水层析，所述疏水层析包括如下步骤：S31：将所述待层析液上样至疏水层析柱；S32：第一次淋洗：采用的第一淋洗液的pH为5.5
±
0.5，所述第一淋洗液包含：12
±
2mM的NaAc、1.7
±
0.5mM的HAc以及0.9
±
0.5M的(NH4)2SO4，所述第一淋洗液的用量≥3倍柱体积，保留时间≥5分钟；
S33：第二次淋洗：采用的第二淋洗液的pH为5
±
0.5，所述第二淋洗液包含：10
±
2mM的NaAc、70
±
5mM的HAc、0.05
±
0.01M精氨酸以及0.6
±
0.5M的(NH4)2SO4，所述第二淋洗液的用量≥3倍柱体积，保留时间≥5分钟；S34：洗脱：采用的第一洗脱液的pH为5
±
0.5，所述第一洗脱液包含：10
±
2mM的NaAc、73
±
5mM的HAc、0.05
±
0.01M精氨酸以及10
±
0.5mM的(NH4)2SO4，所述第一洗脱液的用量≥10倍柱体积，保留时间≥5分钟；收峰参数为峰前250mAU/mm~峰后50mAU/mm。
[0008]在其中一个实施例中，步骤S2中的(NH4)2SO4是以浓度为1M~5M的水溶液形式加入。
[0009]在其中一个实施例中，步骤S31中，上样的载量范围为10~20g/L，上样的温度为18℃~26℃，保留时间≥5分钟。
[0010]在其中一个实施例中，步骤S31中，所述疏水层析柱采用的填料为键合有苯基官能团的疏水填料，粒径为65μm。
[0011]在其中一个实施例中，步骤S31中，所述疏水层析柱采用的填料为TOYOPEARL Phenyl
‑
650M。
[0012]在其中一个实施例中，所述纳米抗体的分子大小为75KD~85KD。
[0013]在其中一个实施例中，步骤S1中，亲和层析的步骤包括：S11：将所述纳米抗体收获液上样至亲和层析柱；S13：采用第三淋洗液进行淋洗，所述第三淋洗液的pH为7
±
0.5，所述第三淋洗液包含：20
±
2mM的Tris、20
±
2mM的HAc以及0.15
±
0.05M的NaCl，所述第三淋洗液的用量≥3倍柱体积，保留时间≥5分钟；S13：采用第二洗脱液进行洗脱，所述第二洗脱液的pH为3
±
0.5，所述第二洗脱液包含：20
±
2mM的NaAc以及20
±
2mM的HAc，所述第二洗脱液的用量≥5倍柱体积，保留时间≥5分钟；收峰参数为峰前50mAU/mm~峰后50mAU/mm。
[0014]在其中一个实施例中，步骤S11中，上样的载量范围为10~50g/L，上样的温度为18℃~26℃，保留时间≥5分钟。
[0015]在其中一个实施例中，步骤S31中，上样至疏水层析柱之前，还包括柱冲洗、消毒和平衡的步骤。
[0016]在其中一个实施例中，柱冲洗的步骤包括：采用注射用水进行冲洗，所述注射用水的用量≥3倍柱体积，保留时间≥3分钟。
[0017]在其中一个实施例中，消毒的步骤包括：采用0.3M~1M的NaOH水溶液进行冲洗，所述NaOH水溶液的用量≥3倍柱体积，保留时间≥3分钟。
[0018]在其中一个实施例中，平衡的步骤包括：采用平衡液冲洗，所述平衡液的用量≥3倍柱体积，保留时间≥3分钟；所述平衡液的pH为5.5
±
0.5，所述平衡液包含：12
±
2mM的NaAc、1.7
±
0.5mM的HAc以及0.9
±
0.5M的(NH4)2SO4。
[0019]上述纳米抗体的层析方法，通过合理设置各工艺步骤，特别是在疏水层析前对样品进行特定的调配，以及采用特定配伍的淋洗液和洗脱液对样品进行疏水层析，能够有效去除样品中的聚集体、宿主细胞蛋白（HCP）和宿主细胞DNA（HCD）。同时，还能够在疏水层析过程中维持纳米抗体的稳定性，减少聚集体的形成。
具体实施方式
[0020]以下结合具体实施例对本专利技术的纳米抗体的层析方法作进一步详细的说明。本专利技术可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式。相反地，提供这些实施方式的目的是使对本专利技术公开内容理解更加透彻全面。
[0021]除本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种纳米抗体的层析方法，其特征在于，包括如下步骤：S1：对纳米抗体收获液进行亲和层析，收集亲和层析洗脱液；S2：调节所述亲和层析洗脱液的pH为5
±
0.5、纳米抗体浓度≤6mg/mL，然后加入(NH4)2SO4调节电导率至80
±
20mS/cm，制备待层析液；S3：对所述待层析液进行疏水层析，所述疏水层析包括如下步骤：S31：将所述待层析液上样至疏水层析柱；S32：第一次淋洗：采用的第一淋洗液的pH为5.5
±
0.5，所述第一淋洗液包含：12
±
2mM的NaAc、1.7
±
0.5mM的HAc以及0.9
±
0.5M的(NH4)2SO4，所述第一淋洗液的用量≥3倍柱体积，保留时间≥5分钟；S33：第二次淋洗：采用的第二淋洗液的pH为5
±
0.5，所述第二淋洗液包含：10
±
2mM的NaAc、70
±
5mM的HAc、0.05
±
0.01M精氨酸以及0.6
±
0.5M的(NH4)2SO4，所述第二淋洗液的用量≥3倍柱体积，保留时间≥5分钟；S34：洗脱：采用的第一洗脱液的pH为5
±
0.5，所述第一洗脱液包含：10
±
2mM的NaAc、73
±
5mM的HAc、0.05
±
0.01M精氨酸以及10
±
0.5mM的(NH4)2SO4，所述第一洗脱液的用量≥10倍柱体积，保留时间≥5分钟；收峰参数为峰前250mAU/mm~峰后50mAU/mm。2.根据权利要求1所述的纳米抗体的层析方法，其特征在于，步骤S2中的(NH4)2SO4是以浓度为1M~5M的水溶液形式加入。3.根据权利要求1所述的纳米抗体的层析方法，其特征在于，步骤S31中，上样的载量范围为10~20g/L，上样的温度为18℃~26℃，保留时间≥5分钟。4.根据权利要求1所述的纳米抗体的层析方法，其特征在于，步骤S31中，所述疏水层析柱采用的填料为键合有苯基官能团的疏水填料，粒径为65μm。5.根据权利要求4所述的纳米抗体的层析方法，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙超，仇金树，罗顺，
申请(专利权)人：澳斯康生物南通股份有限公司甘肃健顺生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：