糖型纯化制造技术

本发明专利技术涉及用具有基于氨基酸的端基的离子交换分离材料分离和纯化糖型的方法。子交换分离材料分离和纯化糖型的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】糖型纯化
[0001]本专利技术涉及用具有基于氨基酸的端基的离子交换分离材料分离和纯化糖型的方法。
[0002]聚糖是糖蛋白分子的必需部分，确保其结构和功能。
[0003]最常见的糖蛋白之一是在Fc部分的CH2结构域中的保守天冬酰胺297处含有两个N
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连接寡糖的免疫球蛋白。聚糖的结构由两个N
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乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)、三个甘露糖和两个GlcNAc残基组成。也可存在其它单糖，例如岩藻糖(Fuc)、半乳糖(Gal)、唾液酸包括N
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乙酰神经氨酸(NANA)或N
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乙醇酰神经氨酸(NGNA)残基。(图1.聚糖结构)。聚糖结构对于糖蛋白和受体亲和结合起重要作用。聚糖组成的改变可以引起糖蛋白的构象转化，影响其特异性受体结合并导致效应子功能的改变。此外，一些聚糖组合物启动保护性生物反应，例如末端甘露糖结合携带甘露糖结合受体(ManR)的效应子。
[0004]此外，通常在源自酵母、昆虫细胞和植物的糖蛋白中发现的含有高末端甘露糖聚糖的糖蛋白在人体内可能是高度免疫原性的(Durocher Y, Butler M. 2009. Expression systems for therapeutic glycoprotein production. Curr Opin Biotechnol 20: 700
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707)。因此，控制生物药物糖蛋白中高末端甘露糖聚糖的水平以避免潜在的免疫原性是非常重要的。
[0005]此外，末端甘露糖和混合聚糖结构降低单克隆抗体(mAb) CH2结构域的构象稳定性。这可能导致更高水平的酶降解或此类分子的短储存时间(Fang, J. Richardson J, Du Z, Zhang Z. Effect of Fc
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Glycan Structure on the Conformational Stability of IgG Revealed by Hydrogen/Deuterium Exchange and Limited Proteolysis, Biochemistry 2016, 55, 860
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868)。
[0006]混合糖基化变体通常在高尔基体中形成。混合糖基化变体显示降低的或改变的糖基化，换言之，不具有期望的糖基化模式。混合形式的一些实例包括G0变体(例如G0
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N)中缺乏N
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乙酰葡萄糖胺或G1变体(例如G1
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N)中缺乏半乳糖的变体(Costa AR, Rodrigues ME, Henriques M, Oliveira R, Azeredo J. Glycosylation: impact, control and improvement during therapeutic protein production, Crit Rev Biotechnol. 2013, 1
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19)。两种所述的混合变体都具有末端甘露糖，从而增加了血液中较短寿命的可能性(Goetze AM, Liu YD, Zhang Z, Shah B, Lee E, Bondarenko PV, Flynn GC. 2011. High mannose glycans on the Fc region of therapeutic IgG antibodies increase serum clearance in humans. Glycobiology 21: 949
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959)。
[0007]此外，较低水平的半乳糖降低补体依赖性细胞毒性(CDC)活性，影响糖蛋白活性。一些研究已经表明，在含有G2
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糖型的mAb和含有G0
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糖型的mAb之间，活性可以降低两倍(Raju TS. 2008. Terminal sugars of Fc glycans influence antibody effector functions of IgGs. Curr Opin Immunol 20: 471
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478)。因此，控制或减少混合糖基化变体，特别是具有末端甘露糖或缺少半乳糖的那些的量的能力将增加糖蛋白的寿命和功效。
[0008]聚糖结构变化的最明显的效果之一是岩藻糖的存在或缺乏。岩藻糖被添加到高尔基体的聚糖结构中。已知mAb的核心聚糖结构中岩藻糖的存在将抑制其与FcγRIIIa受体的
结合，从而降低抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性。与FcγRIIIa受体的特异性结合可以降低50倍，从而对糖蛋白的功效具有很大影响(Peipp等，Antibody fucosylation differentially impacts cytotoxicity mediated by NK and PMN effector cells, BLOOD,，2008年9月15日，112卷，6号，2390
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2399。
[0009]还众所周知，糖基化的缺乏显著降低糖蛋白和受体之间的结合亲和力。例如，mAb糖基化的缺乏显着降低了与FcγRI受体的结合，并消除了与FcγRII和FcγRIII受体的结合(Liu L, Antibody Glycosylation and Its Impact on the Pharmacokinetics and Pharmacodynamics of Monoclonal Antibodies and FC
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Fusion Proteins, Journal of Pharmaceutical Sciences 104: 1866
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1884, 2015)。
[0010]食品和药物管理局(FDA)将生物相似性药物的糖基化相似性评定为最关键的要求之一(FDA，2012. Guidance for industry quality considerations in demonstrating biosimilarity to a reference protein product)。此外，糖基化增强是生物改良药(biobetter)的主要倾向之一。
[0011]由于所有这些原因，在工业中存在着日益增长的需求，即通过控制、富集或分离各种聚糖种类并使其具有最好的药代动力学、功效、半衰期和耐受性来增强糖基化生物药物分子的效率。
[0012]基于其聚糖变体的糖蛋白分离的当前技术水平可以使用离子交换色谱法以富集高甘露糖糖型的制备色谱法模式进行(WO 2014/100117)。不幸的是，在给定的实例中，高甘露糖含量的糖型的富集与聚集体富集重叠，使得如果不能实现包含聚集体的糖蛋白的分离，也难以识别。此外，没有迹象表明该技术可以用于其他聚糖变体的分离或去除。
[0013]用于含高甘露糖糖型的替代技术是使用凝集素的亲和色谱法(US 20020164328)。尽管该技本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.通过使包含蛋白质糖型的样品与包含其表面共价键合至聚合物链的基础基质的分离材料接触来色谱纯化和/或分离蛋白质糖型的方法，其特征在于聚合物链包含端基
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N(Y)
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R3，其中Y彼此独立地是H或CH3，和R3为
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CHCOOMR4其中R4为C1至C4烷基或C1至C4全氟烷基和M是H、Na、K或NH4。2.权利要求1的方法，包括以下步骤a)使包含蛋白质糖型的样品与所述分离材料接触，由此一种或多种蛋白质糖型结合至分离材料b)任选地洗涤分离材料c)在结合的蛋白质糖型从分离材料洗脱的条件下，使分离材料与洗脱缓冲液接触。3.根据权利要求1或权利要求2的方法，其特征在于所述方法还包括回收在步骤a)中流过所述分离材料的蛋白质糖型。4.根据权利要求1至3中一项或多项的方法，其特征在于所述洗脱缓冲液具有比步骤a)中用于使所述样品与所述分离材料接触的上样缓冲液更高的pH。5.根据权利要求1至4中的一项或多项所述的方法，其特征在于，在步骤a)中，在步骤a)中与所述分离材料接触的所述样品具有5 mS/cm至60 mS/cm的电导率。6.根据权利要求1至5中的一项或多项所述的方法，其特征在于，所述样品包括以下中的一种或多种：
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富含甘露糖的蛋白质糖型
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末端甘露糖蛋白质糖型
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岩藻糖基化和非岩藻糖基...

【专利技术属性】
技术研发人员：R，
申请(专利权)人：默克专利股份公司，
类型：发明
国别省市：