rAAV重组包装质粒、用于rAAV包装的质粒系统和rAAV的制备方法技术方案

本发明专利技术提供一种rAAV重组包装质粒、用于rAAV包装的质粒系统和rAAV的制备方法。rAAV重组包装质粒包含pAAV

【技术实现步骤摘要】
rAAV重组包装质粒、用于rAAV包装的质粒系统和rAAV的制备方法


[0001]本专利技术属于生物
，特别是一种rAAV重组包装质粒、用于rAAV包装的质粒系统和rAAV的制备方法。

技术介绍

[0002]腺相关病毒（adeno
‑
associated virus, AAV）是微小病毒科（parvoviridae）家族的成员之一，是一类无法自主复制、无被膜的二十面体微小病毒，其直径约20
‑
26nm，含有4.7kb左右的线状单链DNA作为基因组。
[0003]研究中采用的重组腺相关病毒载体（recombination adeno
‑
associated virus, rAAV）是在非致病的野生型AAV基础上改造而成的基因载体，由于其种类多样、免疫原性极低、安全性高、宿主细胞范围广（对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力）、扩散能力强、体内表达基因时间长等，rAAV被视为最有前途、哺乳动物最安全的基因研究和基因治疗载体之一。
[0004]传统的rAAV制备主要采用三质粒包装病毒法，即采用三质粒共转染包装细胞进行rAAV制备，三质粒包括：含目的基因的pAAV
‑
GOI质粒，提供rep基因、cap基因的pAAV
‑
RC质粒，以及提供E2、E4、VA蛋白基因的pAAV
‑
Ad质粒（也即腺病毒辅助质粒）。传统的三质粒包装病毒法例如CN112888426A公开的病毒包装方法，该包装方法涉及用于重组腺相关病毒载体rAAV产生的质粒系统，其包括：（i）含转基因质粒，其包括由5
ꢀ‘
和3
ꢀ‘
AAV反向末端重复序列ITR侧接的至少一种异源核酸和在所述ITR外部的填充序列；（ii）质粒，其包括AAV复制(Rep)和衣壳(Cap)基因序列；和（iii）腺病毒(Ad)辅助质粒。传统的三质粒包装病毒法再例如于水澜、姜颖等发表的“携带人肝癌细胞CDK2基因的rAAV载体的构建与鉴定”提到的：设计能表达CDK2特异性的小干扰RNA（siRNA），构建pAKD
‑
shRNA
‑
CDK2重组质粒，采用磷酸钙共转染法将pAKD
‑
shRNA
‑
CDK2重组质粒、包装质粒pAVV
‑
RC和辅助质粒pHelper共转染AVV
‑
293细胞。然而，采用传统的三质粒包装病毒法，所得病毒滴度较低。

技术实现思路

[0005]基于此，本专利技术的主要目的是提供一种rAAV重组包装质粒，用其以及含两个末端反向重复序列的质粒和腺病毒辅助质粒包装生产rAAV，能有效提高病毒滴度。
[0006]本专利技术的目的可以通过以下技术方案实现：一种rAAV重组包装质粒，所述rAAV重组包装质粒包含pAAV
‑
RC质粒，以及插入所述pAAV
‑
RC质粒的P5启动子、真核启动子和mir342基因；所述P5启动子位于所述pAAV
‑
RC质粒所含rep基因的上游，用于调控rep基因的表达；所述真核启动子位于所述mir342基因的上游，用于调控所述mir342基因的表达。
[0007]在其中一些实施例中，所述P5启动子位于所述pAAV
‑
RC质粒第1个碱基至第481个
碱基之间或者第7004个碱基至第7350个碱基之间。
[0008]在其中一些实施例中，所述真核启动子为CMV、EF1a、CAG或者SV40。
[0009]一种rAAV重组包装质粒的构建方法，所述构建方法包括在pAAV
‑
RC质粒中插入所述P5启动子、所述真核启动子和所述mir342基因的步骤。
[0010]在其中一些实施例中，在所述pAAV
‑
RC质粒中插入所述P5启动子、所述真核启动子和所述mir342基因的步骤包括：用HpaI酶和EagI酶酶切所述pAAV
‑
RC质粒，制备酶切产物Ⅰ；在所述P5启动子的两端添加HpaI酶和EagI酶的酶切位点片段，用HpaI酶和EagI酶进行双酶切，制备酶切产物Ⅱ；用连接酶连接所述酶切产物Ⅰ和所述酶切产物Ⅱ，制备重组质粒pAAV
‑
P5
‑
RC；用XmaI酶和SnaBI酶双酶切所述pAAV
‑
P5
‑
RC，制备酶切产物Ⅲ；提供包含所述真核启动子和所述mir342基因的连接片段，在所述连接片段的两端添加XmaI酶和SnaBI酶的酶切位点片段，用XmaI酶和SnaBI酶进行双酶切，制备酶切产物Ⅳ；用连接酶连接所述酶切产物Ⅲ和所述酶切产物Ⅳ，制备所述rAAV重组包装质粒。
[0011]在其中一些实施例中，所述HpaI酶的酶切位点片段添加在所述P5启动子的5
’
端，所述EagI酶的酶切位点片段添加在所述P5启动子的3
’
端。
[0012]在其中一些实施例中，所述XmaI酶的酶切位点片段添加在所述连接片段的3
’
端，所述SnaBI酶的酶切位点片段添加在所述连接片段的5
’
端。
[0013]在其中一些实施例中，所述连接酶为T4连接酶。
[0014]一种用于rAAV包装的质粒产品，所述质粒产品包括：含两个末端反向重复序列的质粒、腺病毒辅助质粒和如上所述的rAAV重组包装质粒。
[0015]在其中一些实施例中，所述含两个末端反向重复序列的质粒为pAAV
‑
MCS质粒。
[0016]在其中一些实施例中，所述含两个末端反向重复序列的质粒还包含GOI。
[0017]一种重组细胞，转染有所述的rAAV重组包装质粒，或者转染有所述的质粒产品。
[0018]一种rAAV的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：用如上所述的质粒产品转染包装细胞，培养，收集rAAV。
[0019]在其中一些实施例中，所述包装细胞选自HEK293、HEK293T和HEK293F、HEK293A、Hela、Vero和CHO中的一种或者多种。
[0020]在其中一些实施例中，培养的条件包括：CO2含量为4.5%
‑
5.5%（v/v）的气体环境，温度为36.5℃
‑
37.5℃，时间为48小时
‑
96小时。
[0021]与传统技术相比，本专利技术具备如下有益效果：本专利技术通过在pAAV
‑
RC质粒中插入mir342基因及调控其表达的真核启动子，并同时在其所含rep基因的上游的引入P5启动子用以调控rep基因表达，从而构建得到一种rAAV重组包装质粒，采用包含该rAAV重组包装质粒的三质粒产品包装病毒，能够有效提升病毒滴度，提高产生效率，降低生产成本。
附图说明
[0022]为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种rAAV的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：用质粒产品转染包装细胞，培养，收集rAAV；所述质粒产品包括：含两个末端反向重复序列的质粒、腺病毒辅助质粒和rAAV重组包装质粒；所述rAAV重组包装质粒包含pAAV
‑
RC质粒，以及插入所述pAAV
‑
RC质粒的P5启动子、真核启动子和mir342基因，所述P5启动子位于所述pAAV
‑
RC质粒所含rep基因的上游，用于调控rep基因的表达，所述真核启动子位于所述mir342基因的上游，用于调控所述mir342基因的表达。2.根据权利要求1所述的rAAV的制备方法，其特征在于，所述P5启动子位于所述pAAV
‑
RC质粒第1个碱基至第481个碱基之间或者第7004个碱基至第7350碱基之间。3.根据权利要求1所述的rAAV的制备方法，其特征在于，所述真核启动子为CMV、EF1a、CAG或者SV40。4.根据权利要求1至3任一项所述的rAAV的制备方法，其特征在于，所述rAAV重组包装质粒的构建方法包括在pAAV
‑
RC质粒中插入所述P5启动子、所述真核启动子和所述mir342基因的步骤。5.根据权利要求4所述的rAAV的制备方法，其特征在于，在所述pAAV
‑
RC质粒中插入所述P5启动子、所述真核启动子和所述mir342基因的步骤包括：用Hpa I酶和Eag I酶酶切所述pAAV
‑
RC质粒，制备酶切产物Ⅰ；在所述P5启动子的两端添加Hpa I酶和Eag I酶的酶切位点片段，用Hpa I酶和Eag I酶进行双酶切，制备酶切产物Ⅱ；用连接酶连接所述酶切产物Ⅰ和所述酶切产物Ⅱ，制备重组质粒pAAV
‑
P5<...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯炜，刘汪，庄露，阚子义，罗顺，
申请(专利权)人：澳斯康生物南通股份有限公司甘肃健顺生物科技有限公司健顺生物科技南通有限公司上海澳斯康生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：