一种新型AAV血清型及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种新型AAV血清型及其制备方法，新型AAV血清型的病毒衣壳蛋白包括VP1、VP2和VP3序列，VP3序列的3

【技术实现步骤摘要】
一种新型AAV血清型及其制备方法


[0001]本专利技术属于生物
，特别是一种新型AAV血清型。

技术介绍

[0002]腺相关病毒AAV的Cap蛋白为病毒衣壳蛋白，衣壳由三种亚基VP1、VP2和VP3按比例组成。VP1和VP2蛋白共享VP3序列，并在其N端具有其他残基。VP1的N端具有一个保守的磷脂酶A2序列，该序列与病毒从体内逃逸有关，并对其感染性至关重要；VP3蛋白的核心由保守的β
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桶基序组成，决定了不同血清型AAV与宿主细胞作用受体的差异。许多人体内已经有野生型AAV抗体，因此可能已经有了预防AAV感染的方法。这些预先存在的抗体会干扰病毒与细胞的相互作用，并严重阻碍基因治疗的结果。

技术实现思路

[0003]本专利技术的第一个目的在于针对
技术介绍
中所述的现有的AAV血清型在使用于人体时，人体内可能存在的野生型AAV抗体会干扰病毒与细胞的相互作用，影响基因治疗的效果的问题，提供一种能够解决前述问题的新型AAV血清型。
[0004]为实现以上目的，本专利技术通过以下技术方案予以实现：新型AAV血清型，其病毒衣壳蛋白包括VP1、VP2和VP3序列，VP3序列的3
’
末端为鹿或猪细小病毒序列的AAV VP3序列。
[0005]本专利技术的第二个目的在于提供一种新型AAV血清型的制备方法，其包括以下步骤：S1、将鹿或猪细小病毒的VP3序列与AAV病毒的VP3序列进行比对，确定鹿或猪细小病毒序列可插入AAV病毒的VP3的氨基酸序列位点；S2、将所有病毒外壳蛋白基因序列扩增后，按比例加入，进行无引物PCR反应；S3、以步骤S2中的PCR反应后的序列为模板进行全长PCR反应，获得目的条带；S4、将目的条带无缝克隆进入病毒载体质粒，包装新型AAV血清型，得到的新型AAV血清型，新型AAV血清型的VP3序列的3
’
末端为鹿或猪细小病毒的AAV VP3序列。
[0006]作为上述方案的进一步改进，所述的AAV病毒为AAV2血清型病毒或AAV5血清型病毒。使用AA2血清型病毒或AAV5血清型病毒，都可以用于制备本专利技术的新型AAV血清型。
[0007]作为上述方案的进一步改进，所述的步骤S1中，AAV病毒的VP3序列为AAV2血清型病毒的VP3序列、AAV5血清型病毒的VP3序列，或是AAV2血清型和AAV5血清型的嵌合病毒的VP3序列，即为AAV2.5T序列。
[0008]作为上述方案的进一步改进，步骤S1中，鹿或猪细小病毒的VP3序列与AAV病毒的VP3序列进行比对时，比对其中的同源序列，找出的同源序列位点即为可插入鹿或猪细小病毒序列的氨基酸序列位点。
[0009]作为上述方案的进一步改进，步骤S2中，在病毒外壳蛋白基因序列中插入引物进行引物扩增，扩增后的基因经纯化回收后再混合进行无引物PCR反应。
[0010]本专利技术的有益效果为：1）本专利技术的新型AAV血清型将鹿或猪细小病毒序列替换AAV的3
’
末端，制成的生物基因治疗药物进入人体后，能避免人体内可能预先存在的抗体对病
毒与细胞的相互作用的干扰，提高基因治疗的效果；2）本专利技术的新型AAV血清型的制备方法，可以对AAV2血清型病毒或AAV5血清型病毒的VP3序列的3
’
末端进行替换，替换的氨基酸序列是与之具有同源氨基酸序列的动物的细小病毒序列的AAV VP3序列，采用该方法能制成多种新型AAV血清型，提高基因治疗的效果。
具体实施方式
[0011]下面通过实施例对本专利技术的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0012]实施例1一种新型AAV血清型，其病毒衣壳蛋白包括VP1、VP2和VP3序列，VP1、VP2和VP3序列的比例为1：1：10，该AAV血清型是将AAV2血清型和AAV5血清型的嵌合病毒序列AAV2.5T序列的3
’
末端替换成鹿的细小病毒序列的AAV VP3序列制成的新型AAV血清型。
[0013]新型AAV血清型的制备方法，其包括以下步骤：S1、将鹿细小病毒的VP3序列与AAV2血清型和AAV5血清型的嵌合病毒的VP3序列进行比对，鹿细小病毒的VP3序列为SEQ ID NO：1，AAV2血清型和AAV5血清型的嵌合病毒的VP3序列简称为AAV2.5T序列，其序列为SEQ ID NO：2，确定鹿细小病毒序列可插入AAV2.5T序列的氨基酸序列位点，比对时找出鹿细小病毒的VP3序列与AAV2.5T序列的氨基酸序列中的同源序列，作为插入鹿细小病毒的VP3序列的区域，通过比对找出6组同源序列，详见后面的同源序列；S2、将所有序列扩增后，按比例加入进行无引物PCR反应；S3、以步骤S2中的PCR反应后的序列为模板进行全长PCR反应，获得目的条带；S4、将目的条带无缝克隆进入病毒载体质粒，包装新型AAV血清型，得到的新型AAV血清型的VP3序列的3
’
末端替换成鹿细小病毒的AAV VP3序列，新型AAV血清型的氨基酸序列为SEQ ID NO：3。
[0014]上述步骤S1中，AAV2.5T序列的外壳蛋白基因序列中与鹿细小病毒的VP3序列的6组同源氨基酸序列为：1）AAV2.5T序列中的第203
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213位的氨基酸序列：GDNNQGADGVG。
[0015]鹿细小病毒的VP3序列中的第447
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465位的氨基酸序列：GISNNSTSTASPGGTESQG。
[0016]2）AAV2.5T序列中的第315
‑
324位的氨基酸序列：VTVQDSTTTI。
[0017]鹿细小病毒的VP3序列中的第567
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580位的氨基酸序列：VSMGSGSTSSTYTI。
[0018]3）AAV2.5T序列中的第371
‑
390位的氨基酸序列：TLNRDNTENPTERSSFFCLE。
[0019]鹿细小病毒的VP3序列中的第627
‑
673位的氨基酸序列：TLGGISAEPKEHRITNTSTFCNGTRITNQTWTERHHSVQDSELFLIE。
[0020]4）AAV2.5T序列中的第429
‑
469位的氨基酸序列：NPLVDQYLYRFVSTNNTGGVQFNKNLAGRYANTYKNWFPGP。
[0021]鹿细小病毒的VP3序列中的第712
‑
803位的氨基酸序列：NPCQQLRFYNIKNTHYEDTKQDIDVVMCTSSSDTTCSNECGTSGSNNKIKRKRITVETKGNVDHHNRIQLQNNNVKILRASNTRPAMWLPAP。
[0022]5）AAV2.5T序列中的第557
‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种新型AAV血清型，其病毒衣壳蛋白包括VP1、VP2和VP3序列，其特征在于：VP3序列的3
’
末端为鹿或猪细小病毒序列的AAV VP3序列。2.一种新型AAV血清型的制备方法，其特征在于：其包括以下步骤：S1、将鹿或猪细小病毒的VP3序列与AAV病毒的VP3序列进行比对，确定鹿或猪细小病毒序列可插入AAV病毒的VP3的氨基酸序列位点；S2、将所有病毒外壳蛋白基因序列扩增后，按比例加入，进行无引物PCR反应；S3、以步骤S2中的PCR反应后的序列为模板进行全长PCR反应，获得目的条带；S4、将目的条带无缝克隆进入病毒载体质粒，包装新型AAV血清型，得到的新型AAV血清型，新型AAV血清型的VP3序列的3
’
末端为鹿或猪细小病毒的AAV VP3序列。3.根据权利要求2所述的新型AAV...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐玉旭，马大明，孔令洁，王泱洲，
申请(专利权)人：苏州博腾生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：