可放大的用于纯化重组病毒的方法技术

本公开提供了一种纯化如重组慢病毒等重组病毒的可放大且有成本效益的方法。本文还提供了使用本文所提供的方法纯化的重组病毒(例如，慢病毒)，所述重组病毒的杂质水平低并且活性保留率高。性保留率高。

【技术实现步骤摘要】
可放大的用于纯化重组病毒的方法


[0001]本专利技术总体上涉及一种用于纯化重组病毒的方法。具体地，本专利技术的方法涉及在符合法规要求的条件下对脆弱病毒(如慢病毒载体等)的大规模纯化和回收。

技术介绍

[0002]若干种病毒已经被工程化为用于基因疗法的载体，如逆转录病毒(例如，慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒(AAV)、单纯疱疹病毒(HSV)和牛痘病毒。为了获得满足药物应用要求的重组病毒，需要进行纯化以去除杂质并且在纯化期间最大限度地保留病毒的活性。
[0003]现有的纯化方法总体上涉及如细胞培养物收获、澄清、超滤浓缩、核酸酶消化、柱色谱、浓缩和洗滤等步骤(图1，左小图)。在这些步骤中，柱色谱是去除杂质的关键步骤。用于纯化重组病毒(例如，慢病毒)的常规柱色谱包括分子筛色谱(也称为尺寸排阻色谱)(例如，4FF和6FF)、阴离子交换色谱(例如，EMD DEAE和Capto Q)、亲和色谱(例如，肝素)、阴离子交换膜色谱(例如，Mustang Q、Sarotbind Q和CIM DEAE)和复合模式层析(例如，Capto Core 700，其也可以视为尺寸排阻色谱)。
[0004]离子交换色谱和亲和色谱的纯化原理基于结合
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洗脱模式。在病毒载体与色谱介质结合之后，通过洗涤去除杂质，并且与介质结合的病毒载体可以通过具有高浓度(如0.6～1.0mol/L)的NaCl溶液的洗脱缓冲液从介质上洗脱下来。然而，洗脱期间的高盐浓度通常会使病毒载体或重组病毒失活，由此导致病毒载体的转导/转染效率降低，并且进一步影响通过由病毒载体携带的多核苷酸所编码的治疗剂的功效。
[0005]分子筛色谱的纯化原理基于流通模式，其中根据分子大小分离目标种(例如，重组病毒颗粒)和杂质。基于分子筛色谱的纯化通常对目标样品具有稀释效果，这使得由于其自身负载限制而难以放大。
[0006]复合模式层析的原理是分子筛色谱的原理与离子交换的原理的组合，也就是说，基于流通模式收获目标种(例如，重组病毒颗粒)，而过程相关小分子杂质(如源自包装细胞的蛋白质(即，宿主细胞蛋白质(HCP))和/或源自包装细胞的DNA(即，宿主细胞DNA(HCD)))进入介质孔隙并且以离子交换模式吸收，以实现有效分离。因此，复合模式层析也具有分子筛色谱的缺点，例如对样品的稀释效果。
[0007]另外，常规方法中使用的一步色谱难以将过程相关杂质(尤其是HCP和HCD)控制在相对低的水平，并且不能满足细胞和基因治疗(CGT)药物的相关法规要求和质量标准。
[0008]对于悬浮细胞中产生的病毒(例如，慢病毒)，这可能更具挑战性，因为这通常需要高细胞密度(如3～4
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106个细胞/mL，甚至在一些情况下超过10
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106个细胞/mL)来进行病毒包装以获得高病毒(例如，慢病毒)滴度，这导致HCP和HCD比贴壁细胞的HCP和HCD高出超过10倍。例如，在通过悬浮细胞包装的慢病毒收获上清液中，HCP含量通常为约40
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200μg/mL，并且HCD含量通常为10
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30μg/mL。使用图1所展示的常规方法纯化后，经纯化的病毒制剂(例如，慢病毒制剂)通常的HCP含量为1
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10μg/mL，并且HCD含量为1
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3μg/mL。作为CAR
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T生产中使用的关键材料，具有上述杂质水平的慢病毒制剂将极大地损害细胞治疗产品的质量。
[0009]因此，存在对纯化重组病毒(尤其是极其脆弱的病毒载体，如慢病毒载体)以获得用于临床用途的具有低杂质和高活性的经纯化的重组病毒的可放大的且有成本效益的方法的需求。

技术实现思路

[0010]一方面，本公开提供了一种纯化重组病毒颗粒群的方法，所述方法包括：
[0011]获得包含所述重组病毒颗粒的样品；
[0012]在存在非离子有机聚合物的情况下使所述样品经受包含空间排阻色谱(SXC)介质的SXC柱，使得所述重组病毒颗粒与所述SXC介质结合，其中所述非离子有机聚合物对于所述SXC介质和所述重组病毒颗粒都呈化学惰性；
[0013]用洗脱缓冲液洗脱所述SXC柱，以获得所述重组病毒颗粒的制剂；以及
[0014]使所述重组病毒颗粒的所述制剂经受包含尺寸排阻色谱(SEC)介质的SEC柱，以获得包含所述重组病毒颗粒的流通液体。
[0015]在某些实施方式中，SEC介质是复合模式层析介质，如Capto Core700、Lyer700、Capto Core400、Mix Q
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90、Seplife Suncore 700、Monomix 500或Monomix 1000。
[0016]在某些实施方式中，所述SEC柱的柱高为约5
‑
10cm。
[0017]在某些实施方式中，所述SXC介质选自由以下组成的组：4FF(例如，Sepharose 4FF、Bestarose 4FF、NW Rose 4FF、Seplife 4FF)、6FF(例如，Sepharose 6FF、Bestarose 6FF、NW Rose 6FF、Seplife 6FF)、NW Dex G
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25、NW Super 75、NW Super 100、NW Super 150、NW Super 200、Seplife 6B、Seplife G25、Seplife G75和Seplife G100。在某些实施方式中，所述SXC介质是Sepharose 4FF。
[0018]在某些实施方式中，所述SXC柱的柱高为约5
‑
10cm。
[0019]在某些实施方式中，所述洗脱缓冲液包含0.3
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0.5mol/l(例如，0.4mol/l)的NaCl。在某些实施方式中，所述洗脱缓冲液不含有所述非离子有机聚合物。
[0020]在某些实施方式中，所述非离子有机聚合物是聚乙二醇(PEG)。
[0021]在某些实施方式中，所述PEG的平均分子量介于约4,000(PEG4000)克每摩尔与约15,000(PEG15000)之间，优选地介于约4,000(PEG4000)克每摩尔与约8,000(PEG8000)之间。
[0022]在某些实施方式中，所述PEG的平均分子量为约6,000(PEG6000)克每摩尔。
[0023]在某些实施方式中，所述PEG的浓度为约10
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15％(w/v)。
[0024]在某些实施方式中，所述重组病毒包括编码治疗性蛋白或其片段的转基因。
[0025]在某些实施方式中，所述治疗性蛋白选自由以下组成的组：嵌合抗原受体(CAR)、酶、细胞因子、趋化因子、激素、抗体、抗氧化分子、经工程化的免疫球蛋白样分子、单链抗体、融合蛋白、免疫共刺激分子、免疫调节分子、靶蛋白的跨结构域负性突变体、毒素、条件性毒素、抗原、转录因子、结构蛋白、报告蛋白、亚细胞定位信号、肿瘤抑本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种纯化重组病毒颗粒群的方法，所述方法包括：获得包含所述重组病毒颗粒的样品；在存在非离子有机聚合物的情况下使所述样品经受包含空间排阻色谱(SXC)介质的SXC柱，使得所述重组病毒颗粒与所述SXC介质结合，其中所述非离子有机聚合物对于所述SXC介质和所述重组病毒颗粒都呈化学惰性；用洗脱缓冲液洗脱所述SXC柱，以获得所述重组病毒颗粒的制剂；以及使所述重组病毒颗粒的所述制剂经受包含尺寸排阻色谱(SEC)介质的SEC柱，以获得包含所述重组病毒颗粒的流通液体。2.根据权利要求1所述的方法，其中SEC介质是复合模式层析介质。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述复合模式层析介质选自由以下组成的组：Capto Core700、Lyer700、Capto Core400、Mix Q
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90、Seplife Suncore 700、Monomix 500和Monomix1000。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述SEC柱的柱高为约5
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10cm。5.根据权利要求1所述的方法，其中所述SXC介质选自由以下组成的组：4FF(例如，Sepharose 4FF、Bestarose 4FF、NW Rose 4FF、Seplife 4FF)、6FF(例如，Sepharose 6FF、Bestarose 6FF、NW Rose 6FF、Seplife 6FF)、NW Dex G
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25、NW Super 75、NW Super 100、NW Super 150、NW Super 200、Seplife 6B、Seplife G25、Seplife G75和Seplife G100。6.根据权利要求1所述的方法，其中所述SXC柱的柱高为约5
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10cm。7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述洗脱缓冲液包含0.3
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0.5mol/l的NaCl。8.根据权利要求1所述的方法，其中所述非离子有机聚合物是聚乙二醇(PEG)。9.根据权利要求8所述的方法，其中所述PEG的平均分子量介于约4,000(PEG4000)克每摩尔与约15,000(PEG15000)克每摩尔之间，优选地介于约4,000(PEG4000)克每摩尔与约8,000(PEG8000)克每摩尔之间。10.根据权利要求9所述的方法，其中所述PEG的平均分子量为约6,000(PEG6000)克每摩尔。11.根据权利要求8至10中任一项所述的方法，其中所述PEG的浓度为约10
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15％(w/v)。12.根据权利要求1所述的方法，其中所述重组病毒包括编码治疗性蛋白或其片段的转基因。13.根据权利要求12所述的方法，其中所述治疗性蛋白选自由以下组成的组：嵌合抗原受体(CAR)、酶、细胞因子、趋化因子、激素、抗体...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡迪超，皮川真，翁凯，郭进波，刘海龙，王泱洲，张未萌，华骏，
申请(专利权)人：苏州博腾生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：