一种高效去除宿主细胞残留蛋白的腺病毒纯化方法技术

本发明专利技术公开了一种高效去除宿主细胞残留蛋白的腺病毒纯化方法，适用于腺病毒的纯化生产。该纯化工艺包括下述步骤：病毒收获液经过Tween

【技术实现步骤摘要】
一种高效去除宿主细胞残留蛋白的腺病毒纯化方法


[0001]本专利技术属于病毒纯化技术
，具体涉及一种高效去除宿主细胞残留蛋白的腺病毒纯化方法。

技术介绍

[0002]宿主细胞蛋白(HCP)是构成生物药物中过程相关的主要杂质。与HCP相关的风险主要是免疫原性。HCP是具有多种生理化学和免疫学特性的复杂混合物。由于可能在人体内引发免疫反应，因此几乎所有HCP都有作为外来蛋白药物的临床安全风险。此外，某些HCP还可以充当佐剂来增强生物药物产品的免疫反应。某些具有蛋白水解活性的HCP，如果未充分去除或失活，也会影响药品的稳定性和功效。因此，在腺病毒的纯化生产过程中要尽可能地除去宿主细胞蛋白，监控HCP的残留量，以确保生物制品的质量和安全。
[0003]一般常规的腺病毒纯化方法，对于大规模培养的腺病毒，其培养液杂质含量多情况下，去除杂质不够彻底，尤其对HCP的去除效果不好，难以获得合格的原液。

技术实现思路

[0004]针对上述
技术介绍
所提出的问题，本专利技术的目的是：旨在提供一种高效去除宿主细胞残留蛋白的腺病毒纯化方法。
[0005]为实现上述技术目的，本专利技术采用的技术方案如下：
[0006]一种高效去除宿主细胞残留蛋白的腺病毒纯化方法，该腺病毒纯化方法包括下述步骤，
[0007]S1.细胞裂解，病毒收获液经过Tween
‑
80裂解以及核酸酶处理；
[0008]S2.澄清浓缩，使用深层过滤器和膜过滤器对病毒收获液进行澄清处理，然后使用中空纤维柱对澄清液进行浓缩和洗滤；
[0009]S3.精纯，分别用Source 30Q阴离子交换层析填料和Capto Q阴离子交换层析填料对溶液进行精纯；
[0010]S4.置换除菌，使用Sepharose 4Fast Flow层析填料对离子交换收获液进行进一步纯化以及置换保存液，经除菌过滤后，获得原液。
[0011]本专利技术的有益效果：
[0012]1.在现有纯化方法的基础上，提供了两步离子交换层析方案为主要技术特征的腺病毒纯化方法，以使原液中的HCP含量符合标准(100ng/1
×
10
11
VP)。
附图说明
[0013]本专利技术可以通过附图给出的非限定性实施例进一步说明；
[0014]图1为本专利技术实施例的纯化流程图；
[0015]图2为本专利技术对比例的纯化流程图；
[0016]图3为本专利技术实施例Source 30Q离子交换层析图谱；
[0017]图4为本专利技术实施例Capto Q离子交换层析图谱；
[0018]图5为本专利技术实施例S4FF分子筛层析图谱；
[0019]图6为本专利技术对比例Capto Q离子交换层析图谱；
[0020]图7为本专利技术对比例S4FF分子筛层析图谱。
具体实施方式
[0021]为了使本领域的技术人员可以更好地理解本专利技术，下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
[0022]实验仪器设备如下：
[0023]AKTApure纯化仪，生物安全柜，AKTAFlux 6切向流过滤系统等；
[0024]Zeta Plus EZP深层过滤器，规格：Е16Е07А60SP02A，1.6m2。
[0025]中空纤维柱：UFP
‑
300
‑
E
‑
8A(Cytiva)，3600cm2，300KDa。
[0026]离子交换层析柱：直径100mm层析柱(利穗)，Source 30Q填料(Cytiva)，约1000ml。
[0027]离子交换层析柱：直径100mm层析柱(利穗)，Capto Q填料(Cytiva)，约800ml。
[0028]分子筛层析柱：直径72mm层析柱(利穗)，Sepharose 4Fast Flow填料(Cytiva)，约3000ml。
[0029]离子交换层析柱：直径26mm层析柱(Cytiva)，Capto Q填料(Cytiva)，约30ml。
[0030]分子筛层析柱：规格26/40层析柱(博格隆)，Sepharose 4Fast Flow填料(Cytiva)，约160ml。
[0031]实验情况：
[0032]本次实验有实施例与对比例两组实验，样品均来源于一批司内生产的50LWAVE细胞袋培养的收获液。
[0033]实施例
[0034]本实施例的腺病毒纯化方法，其包括以下步骤：
[0035]1.细胞裂解
[0036]由50L WAVE细胞袋中染毒扩增培养，获得腺病毒细胞收获液，细胞裂解条件是使用0.5％Tween
‑
80于37℃裂解2h，然后加入浓度为20U/ml的核酸酶继续处理3小时，再用添加终浓度为300mM的NaCl终止酶切30min。
[0037]2.深层过滤
[0038]处理后的细胞收获液通过3M深层过滤器过滤，先用300mM氯化钠溶液冲洗深层过滤器，将深层过滤器进液端管路放入细胞收获液，出液端放入干烤过容器中，调节蠕动泵设置适当流速0.5mL/cm2/min调节泵压力，进行深层过滤，深层过滤完成后，用少量300mM氯化钠溶液清洗过滤器，排空滤器，得深层过滤收集液滤。
[0039]3.0.5/0.2μm过滤
[0040]过滤套筒及硅胶管泡碱清洗后与滤芯组装好，将入口和出口分别连接硅胶管。将进样端的管子插入待过滤溶液中，出口端用注射用水冲洗后，放入干烤过的瓶子中。启动蠕动泵，设置流速600
‑
1000ml/min，收集滤液。
[0041]4.浓缩洗滤
[0042]选择中空纤维柱(3600cm2，300KD)，连接切向流超滤浓缩系统AKTAFlux 6，用注射
用水冲洗中空纤维柱5min，0.5M NaOH循环30min，再用注射用水清洗中空纤维柱直至回流端及透过端pH为中性，排空。设置剪切力低于2000，控制TMP小于15，超滤浓缩5
‑
10倍后，30％B液冲洗，停止浓缩，控制浓度在2
×
10
12
VP/ml以下，避免病毒聚集。接着浓缩液使用A液对倍稀释洗滤3次以上。留取一小部分样品用于对比例实验。
[0043]5.Source 30Q(简称：S30Q)离子交换层析
[0044]离子交换层析柱：直径100mm层析柱(利穗)，Source 30Q填料(Cytiva)，约1000ml。
[0045]上样量按柱载量为1.0
×
10
12
VP/ml载量，样品补加B液至含30％B液，30cm/h的流速上样，进行离子交换层析，然后用30％B液按45cm/h的流速洗杂约4
‑
6CV，30％～60％B液洗脱4
‑
6CV，观察出峰情况，收集目标峰，并送检。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高效去除宿主细胞残留蛋白的腺病毒纯化方法，其特征在于：该腺病毒纯化方法包括下述步骤，S1.细胞裂解，病毒收获液经过Tween
‑
80裂解以及核酸酶处理；S2.澄清浓缩，使用深层过滤器和膜过滤器对病毒收获液进行澄清处理，然后使用中空纤维柱对澄清液进行浓缩和洗滤；S3.精纯，分别用Source 30Q阴离子交换层析填料和Capto Q阴离子交换层析填料对溶液进行精纯；S4.置换除菌，使用Sepharose 4Fast Flow层析填料对离子交换收获液进行进一步纯化以及置换保存液，经除菌过滤后，获得原液。2.根据权利要求1所述的一种高效去除宿主细胞残留蛋白的腺病毒纯化方法，其特征在于：细胞裂解条件是使用0.5％Tween
‑
80于37℃裂解2h，然后加入浓度为20U/ml的核酸酶继续处理3小时，再用添加终浓度为300mM的NaCl终止酶切30min。3.根据权利要求1所述的一种高效去除宿主细胞残留蛋白的腺病毒纯化方法，其特征在于：膜过滤器规格为0.5/0.2μm。4.根据权利要求1所述的一种高效去除宿主细胞残留蛋白的腺病毒纯化方法，其特征在于：中空纤维柱孔径为300kDa。5.根据权利要求1所述的一种高效去除宿主细胞残留蛋白的腺病毒纯化方法，其特征在于：洗滤处理过程中采用A液，所使用的A液体系为50mM Tris
‑
HCl，2mM MgCl2(pH 8.0)，洗滤次数大于或等于3次。6.根据权利要求1所述的一种高效去除宿主细胞残留蛋白的腺病毒纯化方法，其特征在于：Source 30Q...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖永强，王三刚，陈丽婷，
申请(专利权)人：深圳源兴基因技术有限公司，
类型：发明
国别省市：