一种微载体痘病毒高效培养方法技术

本发明专利技术公开了一种微载体痘病毒高效培养方法，属于生物培养技术领域，包括：S1.细胞的复苏与传代；S2.膜式微载体的准备工作；S3.生物反应器的准备工作；S4.细胞的收集与培养；S5.痘病毒的感染；S6.痘病毒的维持培养和收获；膜式微载体包括基质层和配基层，基质层包括以下的原料包括以下组分：按重量计，60～70份聚乙烯醇、18～30份聚己内酯、10～20份精氨酸、5～16份天然多糖；配基层的原料包括以下组分：按重量计，90～100份聚四氟乙烯、20～30份氧化铈、6～10份酞菁铁。解决了痘病毒培养效率低问题，实现对痘病毒的高效培养。具有病毒产量高，培养时间短的优势。培养时间短的优势。

【技术实现步骤摘要】
一种微载体痘病毒高效培养方法


[0001]本专利技术涉及生物培养
，具体涉及一种微载体痘病毒高效培养方法。

技术介绍

[0002]痘苗病毒（VACV或VV）是一种大型的、复杂的包膜病毒，属于痘病毒家族。痘苗病毒（VACV或VV）有一个线性的双链DNA基因组，长度约为190kbp，可编码的基因约有250个。通过同源重组将外源基因插入到痘苗病毒基因组内，以痘苗病毒为载体使外源基因在动物细胞内表达以获得目的蛋白，从而达到免疫接种的目的。痘苗病毒的宿主范围广，不仅允许插入长片段的外源基因，还可通过多种途径进行接种，能诱导体液和细胞免疫反应并且易于增殖生产，在疫苗研制中得到了广泛的应用。此外，痘苗病毒被证明具有裂解肿瘤细胞的能力，因此，结合肿瘤免疫治疗基因的改造，可更有效的实现肿瘤的溶瘤治疗效果。
[0003]目前重组痘病毒载体采用的是细胞培养瓶或摇瓶小规模的培养293T细胞、hela细胞尚未实现规模化生产。
[0004]现有技术文献中，如专利公开号为CN115197966A的一种利用生物反应器大规模生产重组痘苗病毒载体的方法中，记载了通过实现培养规模的放大和实现产业化，同时解决一般生产中重组痘病毒不易释放出细胞导致获得的病毒滴度低的缺陷，获得了高滴度的重组痘病毒，提高痘病毒的产量和质量。同时，现有技术中，如专利公开号为CN113621479A的一种高产量水痘病毒培养用透气膜及其培养方法中，记载了通过聚二甲基硅氧烷复合膜和聚己内酯复合膜形成载体，不仅提高了氧气供应，同时提高了细胞的粘附性，进而实现了水痘病毒的高产量培养。
[0005]但是，利用生物反应器进行微载体痘病毒培养采用的贴壁法需要21～30天，时间长，效率相对较低，而单纯依赖透气膜的方式，仅能起到协同增强水痘病毒的增殖分化的作用。因此，亟需一种能进一步提高痘病毒培养效率的方法，以实现微载体痘病毒高效培养。

技术实现思路

[0006]为此，本专利技术提供一种微载体痘病毒高效培养方法，以解决现有技术中存在的相关技术问题。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：根据本专利技术提供的一种微载体痘病毒高效培养方法，包括：S1.细胞的复苏与传代；S2.膜式微载体的准备工作；S3.生物反应器的准备工作；S4.细胞的收集与培养；S5.痘病毒的感染；S6.痘病毒的维持培养和收获；所述膜式微载体包括基质层和配基层，所述基质层包括以下的原料包括以下组
分：按重量计，60～70份聚乙烯醇、18～30份聚己内酯、10～20份精氨酸、5～16份天然多糖；所述配基层的原料包括以下组分：按重量计，90～100份聚四氟乙烯、20～30份氧化铈、6～10份酞菁铁；所述S2包括：（1）使用二萘酚混合溶剂将聚乙烯醇和聚己内酯溶解，然后将10～15%水溶性天然多糖溶于50～60℃热水中，得到15～25wt%水溶性天然多糖溶液，并将所得的两种溶液混合并搅拌均匀后进行静电纺丝，得到纤维膜，将其置于精氨酸水溶液中，振荡反应，用水洗涤，得到第一基质；（2）将第一基质活化后抽干，采用交联剂与正电荷修饰剂化学交联，得到的带正电荷的基质层再与蛋白多肽～壳聚糖纳米粒交联，再通过加入缓冲液中，搅拌反应，将反应后的产物依次用去离子水清洗抽干，得到带正电荷的基质层；（3）将氧化铈和聚四氟乙烯加入DMSO溶剂中搅拌溶解；加入聚二甲基硅氧烷搅拌；加入酞菁铁搅拌均匀，得到铸膜溶液；将其涂布在模板上，脱气，初干燥，得到配基层；（4）将基质层其中一面喷涂聚二甲基硅氧烷水溶液，并以其为接触面，覆盖在聚二甲基硅氧烷复合膜上，干燥拉伸后，得到膜式微载体。
[0008]进一步地，所述（2）中正电荷修饰的具体过程如下：将十六烷基三甲基溴化铵溶于水中，搅拌，加入3mol/L的氢氧化钠溶液，将所得的混合溶液与第一基质混合；其中，十六烷基三甲基溴化铵与氢氧化钠溶液质量体积比为1：2.5g/mL；将所得混合液加热至80℃，并于80℃恒温、搅拌、回流反应8～12h，冷却后，依次用去离子水和缓冲液清洗，抽干，将洗净抽干后的带正电荷的第一基质与蛋白多肽～壳聚糖纳米粒一起加入缓冲液中，搅拌反应、冷凝后清洗抽干；即得蛋白多肽～壳聚糖纳米粒覆层的带正电荷微载体。
[0009]进一步地，交联剂为聚乙烯亚胺、碳化二亚胺、二异氰酸酯或其中至少两种的混合物；交联剂的用量为0.1～80mmol/g微球，交联反应温度为25～65℃，交联反应时间为3～24h。
[0010]进一步地，所述正电荷修饰剂包括胺或胺盐、铵盐、胆碱类化合物和阳离子聚合物。
[0011]进一步地，所述S1包括：将293T细胞接种于完全RPMI1640培养基后，将RPMI1640培养基置于37℃，5%、8%或10%CO2培养箱中的摇床上进行悬浮培养，摇床转速为50～120rpm，细胞长成单层后，消化细胞，并制成均匀的细胞悬液，将所制得的细胞悬液分种于培养瓶中，加入细胞培养液继续培养，细胞连续传代3～5次，并接种于10层细胞工厂然后加入细胞培养液继续培养。
[0012]进一步地，所述S4包括：293T细胞复苏、传代培养后取样计数，用含10%FBS的DMEM生长液将293T细胞调整为5
×
105个/mL，再接种到生物反应器上进行培养，初始密度为2～5
×
105个/mL，细胞培养初始设定搅拌转速为50～90rpm，随着细胞生长和DO控制，逐渐加大搅拌转速至80～120rpm，细胞培养液是10%血清DMEM培养液，培养过程中可通过监测葡萄糖浓度，计算葡萄糖的消耗情况来反映、监测细胞的分裂生长情况；当葡萄糖浓度下降至2～3g/L，开始灌注。
[0013]进一步地，所述S3中，生物反应器在使用前需要的准备工作包括电极校正、灭菌、
平衡，具体方法如下：(1)选择14～20L的生物反应器，连接好各种管道和补料，换液的接口，接上温度、pH、DO电极，对电极进行校正；(2)在生物反应器中装入适量的PBS，关闭出气口后向罐内补气，停止补气后维持压力，检查各管道和接头后进行气密性测试，检查罐体和连接瓶的气密性；(3)测试合格后方可准备进行灭菌，向罐体里加入S2中制备的膜式微载体，加入10～12LPBS，然后将罐体连同其中的膜式微载体及PBS一并经高压蒸汽灭菌，蒸汽灭菌的温度为121℃，时长为15～30min。
[0014]进一步地，所述S5包括：将重组痘病毒接入细胞罐中，MOI为0.05～0.4，感染5h，搅拌转速40～60rpm，pH5～8自动调节，溶氧(DO)20～50%自动调节，培养温度35℃，6h后开启灌注，灌注量2.5～4VVD。
[0015]进一步地，所述S6包括：所述痘病毒的维持培养及收获的步骤为：染毒24h，罐内液体和灌流培养液更换为DMEM培养液，继续灌流培养至染毒48～96h，排空罐内液体，加入高渗透压收获液，室温静置5～30min，待显微镜下细胞发生明显收缩时震摇，使细胞脱壁，收集病毒液，加注射水，使细胞渗透压恢复至等渗。
[0016]进一步地，所述膜式微载体的电荷密本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种微载体痘病毒高效培养方法，其特征在于，包括：S1.细胞的复苏与传代；S2.膜式微载体的准备工作；S3.生物反应器的准备工作；S4.细胞的收集与培养；S5.痘病毒的感染；S6.痘病毒的维持培养和收获；所述膜式微载体包括基质层和配基层，所述基质层包括以下的原料包括以下组分：按重量计，60～70份聚乙烯醇、18～30份聚己内酯、10～20份精氨酸、5～16份天然多糖；所述配基层的原料包括以下组分：按重量计，90～100份聚四氟乙烯、20～30份氧化铈、6～10份酞菁铁；所述S2包括：（1）使用二萘酚混合溶剂将聚乙烯醇和聚己内酯溶解，然后将10～15%水溶性天然多糖溶于50～60℃热水中，得到15～25wt%水溶性天然多糖溶液，并将所得的两种溶液混合并搅拌均匀后进行静电纺丝，得到纤维膜，将其置于精氨酸水溶液中，振荡反应，用水洗涤，得到第一基质；（2）将第一基质活化后抽干，采用交联剂与正电荷修饰剂化学交联，得到的带正电荷的基质层再与蛋白多肽～壳聚糖纳米粒交联，再通过加入缓冲液中，搅拌反应，将反应后的产物依次用去离子水清洗抽干，得到带正电荷的基质层；（3）将氧化铈和聚四氟乙烯加入DMSO溶剂中搅拌溶解；加入聚二甲基硅氧烷搅拌；加入酞菁铁搅拌均匀，得到铸膜溶液；将其涂布在模板上，脱气，初干燥，得到配基层；（4）将基质层其中一面喷涂聚二甲基硅氧烷水溶液，并以其为接触面，覆盖在聚二甲基硅氧烷复合膜上，干燥拉伸后，得到膜式微载体。2.如权利要求1所述的微载体痘病毒高效培养方法，其特征在于，所述（2）中正电荷修饰的具体过程如下：将十六烷基三甲基溴化铵溶于水中，搅拌，加入3mol/L的氢氧化钠溶液，将所得的混合溶液与第一基质混合；其中，十六烷基三甲基溴化铵与氢氧化钠溶液质量体积比为1：2.5g/mL；将所得混合液加热至80℃，并于80℃恒温、搅拌、回流反应8～12h，冷却后，依次用去离子水和缓冲液清洗，抽干，将洗净抽干后的带正电荷的第一基质与蛋白多肽～壳聚糖纳米粒一起加入缓冲液中，搅拌反应、冷凝后清洗抽干；即得蛋白多肽～壳聚糖纳米粒覆层的带正电荷微载体。3.如权利要求1所述的微载体痘病毒高效培养方法，其特征在于，交联剂为聚乙烯亚胺、碳化二亚胺、二异氰酸酯或其中至少两种的混合物；交联剂的用量为0.1～80mmol/g微球，交联反应温度为25～65℃，交联反应时间为3～24h。4.如权利要求1所述的微载体痘病毒高效培养方法，其特征在于，所述正电荷修饰剂包括胺或胺盐、铵盐、胆碱类化合物和阳离子聚合物。5.如权利要求1所述的微载体痘病毒高效培养方法，其特征在于，所述S1包括：将293T细胞接种于完全RPMI1640培...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈彦平，余哲琪，黄伟东，胡春凌，
申请(专利权)人：深圳源兴基因技术有限公司，
类型：发明
国别省市：