【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因治疗，尤其涉及一种痘苗病毒的高产培养方法。
技术介绍
1、痘病毒组成特征在于大的、线性dsdna基因组、用于繁殖的细胞质位点和复杂的病毒粒形态学的病毒的大家族。痘苗病毒（vacv）是此组病毒的代表性病毒并且是关于病毒形态发生研究的最多的病毒。
2、通过同源重组将外源基因插入到痘苗病毒基因组内，以痘苗病毒为载体使外源基因在动物细胞内表达以获得目的蛋白，从而达到免疫接种的目的。痘苗病毒的宿主范围广，不仅允许插入长片段的外源基因，还可通过多种途径进行接种，能诱导体液和细胞免疫反应并且易于增殖生产，在疫苗研制中得到了广泛的应用。
3、公开号为cn115197966a的专利文献公开了一种利用生物反应器大规模生产重组痘苗病毒载体的方法，其包括以下步骤：s1、细胞的复苏与传代；s2、生物反应器的准备工作；s3、细胞的收集与培养；s4、痘病毒的感染；s5、痘病毒的维持培养及收获，所述细胞的复苏与传代是将293贴壁细胞加入细胞维持液后放入到co2培养箱中培养，细胞长成单层后，消化细胞，并制成均匀的细胞悬液，分种于培养瓶中，加入细胞维持液继续培养，细胞这样传代2-3次后，消化收集培养瓶中的细胞，并接种于10层细胞工厂，然后加入细胞维持液继续培养。
4、但是，现有技术在细胞培养方面存在局限，使得痘苗病毒的产量不高。
技术实现思路
1、为此，本专利技术提供一种痘苗病毒的高产培养方法，可以解决了在进行细胞培养过程中的营养液的消耗速度限制导致的病毒的收获率
2、为实现上述目的，本专利技术提供痘苗病毒的高产培养方法，该方法包括：
3、将细胞悬液接种至含有细胞生长液的生物反应器中用以进行细胞的增殖培养；
4、通过葡萄糖浓度传感器检测生物反应器中细胞的实际葡萄糖浓度，并根据所述葡萄糖浓度得到葡萄糖消耗量；
5、当所述葡萄糖消耗量降低并趋于平稳时则弃去所述细胞生长液，加入细胞维持液按照预设的病毒感染复数接种痘苗病毒；
6、将接种后的细胞进行培养；
7、到达预设的培养时间后排空生物反应器中的细胞维持液，加入病毒裂解液进行裂解并离心收获上清液用以完成病毒液的收获；
8、其中，将接种后的细胞进行培养时，启动搅拌装置进行搅拌，所述搅拌装置上设置有若干应变片用以接收细胞悬液的冲击力，并根据各所述应变片的平均冲击力确定搅拌装置的速度状态，并根据所述速度状态进行判断得到判断结果，并根据所述判断结果确定是否调整搅拌装置的速度；
9、通过溶氧探针实时监测细胞的实际溶氧浓度，若调节后的速度达到搅拌速度的极大值且所述实际溶氧浓度不属于所述标准溶氧浓度区间，则调节空气流通量用以将实际溶氧浓度控制在标准范围内。
10、具体而言，本领域技术人员可将病毒感染复数（moi）设置在[0.01，0.2]的范围内，量纲为pfu。本领域技术人员可将预设的培养时间设置在[70，120]的范围内，量纲为h。
11、进一步地，启动搅拌装置进行搅拌时，所述搅拌装置上设置有若干应变片用以接收细胞悬液的冲击力，设置细胞悬液冲击力函数f=f（tn），t表示在预设周期t内细胞悬液对应变片n的冲击力，
12、根据各所述应变片受到的冲击力得到平均冲击力ff，
13、若所述平均冲击力ff小于预设的标准冲击力f0，则确定搅拌装置处于第一速度状态；
14、若所述平均冲击力ff大于预设的标准冲击力f0，则确定搅拌装置处于第二速度状态；
15、若所述平均冲击力ff等于预设的标准冲击力f0，则确定搅拌装置处于标准搅拌速度状态；
16、若搅拌装置处于第一速度状态下，或，若搅拌装置处于第二速度状态，则以预设的标准采集频率采集预设周期内的溶氧浓度，并以采集时间为横坐标，溶氧浓度为纵坐标建立坐标系用以生成溶氧浓度曲线；
17、若所述溶氧浓度曲线呈现稳定波动的状态，则判断不调整搅拌装置的预设的标准搅拌速度v0；
18、若所述溶氧浓度曲线呈现线性上升的状态，或，若所述溶氧浓度曲线呈现线性下降的状态，则判断调整搅拌装置的预设的标准搅拌速度v0至对应值；
19、若搅拌装置处于标准搅拌速度状态下，则判断不调整搅拌装置的预设的标准搅拌速度v0,
20、其中，所述第一速度小于标准搅拌速度小于第二速度。
21、进一步地，调整搅拌装置的预设的标准搅拌速度v0至对应值时，根据实际溶氧浓度差值与预设的标准溶氧浓度差值进行比较得到比较结果，根据比较结果调节所述标准搅拌速度，并根据调节后的搅拌速度进行搅拌。
22、进一步地，根据实际溶氧浓度差值与预设的标准溶氧浓度差值进行比较得到比较结果，根据比较结果调节所述标准搅拌速度时，
23、计算实际溶氧浓度差值并根据所述实际溶氧浓度差值与预设的第一标准溶氧浓度差值△c1和第二标准溶氧浓度差值△c2的关系所确定的第一速度调节系数α1、第二速度调节系数α2或第三速度调节系数α3对所述标准搅拌速度进行反向调节；
24、以及，计算实际溶氧浓度差值并根据实际溶氧浓度差值与预设的第一标准溶氧浓度差值△c1’和第二标准溶氧浓度差值△c2’的关系所确定的第四速度调节系数α1’、第五速度调节系数α2’或是第六速度调节系数α3’对所述标准搅拌速度进行正向调节。
25、进一步地，计算实际溶氧浓度差值时，
26、当实际溶氧浓度c大于cmax时，计算实际溶氧浓度差值△c，其中△c=c-cmax；
27、当实际溶氧浓度c小于cmin时，计算实际溶氧浓度差值△c’，其中，△c’=cmin-c；
28、进一步地，根据所述实际溶氧浓度差值与预设的第一标准溶氧浓度差值△c1和第二标准溶氧浓度差值△c2的关系所确定的第一速度调节系数α1、第二速度调节系数α2或第三速度调节系数α3对所述标准搅拌速度进行反向调节时，
29、当实际溶氧浓度差值△c小于等于第一标准溶氧浓度差值△c1时，则选取第一速度调节系数α1调节所述标准搅拌速度v0至v1=v0（1-α1），其中，α1=（△c1-△c）/（10×△c1）；
30、当实际溶氧浓度差值△c大于第一标准溶氧浓度差值△c1且小于第二标准溶氧浓度差值△c2时，则选取第二速度调节系数α2调节所述标准搅拌速度v0至v2=v0（1-α2），其中，α2=（△c-△c1）/（10×（△c2-△c1））；
31、当实际溶氧浓度差值△c大于等于第二标准溶氧浓度差值△c2时，则选取第三速度调节系数α3调节所述标准搅拌速度v0至v3=v0（1-α3），其中，α3=（△c-△c2）/（10×△c）。
32、进一步地，根据实际溶氧浓度差值与预设的第一标准溶氧浓度差值△c1’和第二标准溶氧浓度差值△c2’的关系所确定的第四速度调节系数α1’、第五速度调节系数α2’或是第六速度调节系数α3’对所述标准搅拌速度进行本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种痘苗病毒的高产培养方法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的痘苗病毒的高产培养方法，其特征在于，启动搅拌装置进行搅拌时，所述搅拌装置上设置有若干应变片用以接收细胞悬液的冲击力，设置细胞悬液冲击力函数F=f（tn），t表示在预设周期t内细胞悬液对应变片n的冲击力，
3.根据权利要求2所述的痘苗病毒的高产培养方法，其特征在于，调整搅拌装置的预设的标准搅拌速度V0至对应值时，根据实际溶氧浓度差值与预设的标准溶氧浓度差值进行比较得到比较结果，根据比较结果调节所述标准搅拌速度，并根据调节后的搅拌速度进行搅拌。
4.根据权利要求3所述的痘苗病毒的高产培养方法，其特征在于，根据实际溶氧浓度差值与预设的标准溶氧浓度差值进行比较得到比较结果，根据比较结果调节所述标准搅拌速度时，
5.根据权利要求4所述的痘苗病毒的高产培养方法，其特征在于，计算实际溶氧浓度差值时，
6.根据权利要求5所述的痘苗病毒的高产培养方法，其特征在于，根据所述实际溶氧浓度差值与预设的第一标准溶氧浓度差值△C1和第二标准溶氧浓度差值△C2的关系所确定的第
7.根据权利要求6所述的痘苗病毒的高产培养方法，其特征在于，根据实际溶氧浓度差值与预设的第一标准溶氧浓度差值△C1’和第二标准溶氧浓度差值△C2’的关系所确定的第四速度调节系数α1’、第五速度调节系数α2’或是第六速度调节系数α3’对所述标准搅拌速度进行正向调节时，
8.根据权利要求7所述的痘苗病毒的高产培养方法，其特征在于，若调节后的速度达到搅拌速度的极大值且所述实际溶氧浓度不属于所述标准溶氧浓度区间，则调节空气流通量用以控制溶氧浓度，
9.根据权利要求8所述的痘苗病毒的高产培养方法，其特征在于，预设的标准冲击力F0为在搅拌装置在标准搅拌速度下细胞悬液对应变片的冲击力。
10.根据权利要求9所述的痘苗病毒的高产培养方法，其特征在于，将细胞悬液接种至含有细胞生长液的生物反应器中用以进行细胞的增殖培养包括：将HEK293悬浮细胞复苏后，按2.5×105-4.0×105cells/mL种于75cm2培养瓶，放入37℃、5%CO2培养箱中培养，连续培养传代2-3次，取培养的HEK293悬浮细胞计数，细胞活性需高于90%，加入完全培养液稀释，按4.0×105-6.0×105cells/mL接种于搅拌式细胞培养瓶中，放入37℃、5%CO2、120rpm振荡培养箱中培养，连续培养传代2-3次，取培养的HEK293悬浮细胞计数，细胞活性需高于90%，加入完全培养液稀释，5.0×105-8.0×105cells/mL接种于3L搅拌式细胞培养瓶中，放入37℃、5%CO2、120rpm振荡培养箱中连续培养至足量，获得的细胞悬液作为种子细胞，种子细胞按5.0×105-8.0×105cells/mL的细胞密度接种至10L生物反应器中，进入生物反应器细胞培养阶段，待生物反应器的参数稳定，根据细胞计数结果、当前培养体积和病毒悬液病毒感染滴度计算，将滤后的痘苗病毒毒种以MOI＝0.01-0.2的比例接种至生物反应器，最终培养体积10L，进入生物反应器病毒培养阶段，培养至病毒感染70-120h，葡萄糖消耗量降低至20.00g/天则停止培养，裂解收获痘苗病毒。
...【技术特征摘要】
1.一种痘苗病毒的高产培养方法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的痘苗病毒的高产培养方法，其特征在于，启动搅拌装置进行搅拌时，所述搅拌装置上设置有若干应变片用以接收细胞悬液的冲击力，设置细胞悬液冲击力函数f=f（tn），t表示在预设周期t内细胞悬液对应变片n的冲击力，
3.根据权利要求2所述的痘苗病毒的高产培养方法，其特征在于，调整搅拌装置的预设的标准搅拌速度v0至对应值时，根据实际溶氧浓度差值与预设的标准溶氧浓度差值进行比较得到比较结果，根据比较结果调节所述标准搅拌速度，并根据调节后的搅拌速度进行搅拌。
4.根据权利要求3所述的痘苗病毒的高产培养方法，其特征在于，根据实际溶氧浓度差值与预设的标准溶氧浓度差值进行比较得到比较结果，根据比较结果调节所述标准搅拌速度时，
5.根据权利要求4所述的痘苗病毒的高产培养方法，其特征在于，计算实际溶氧浓度差值时，
6.根据权利要求5所述的痘苗病毒的高产培养方法，其特征在于，根据所述实际溶氧浓度差值与预设的第一标准溶氧浓度差值△c1和第二标准溶氧浓度差值△c2的关系所确定的第一速度调节系数α1、第二速度调节系数α2或第三速度调节系数α3对所述标准搅拌速度进行反向调节时，
7.根据权利要求6所述的痘苗病毒的高产培养方法，其特征在于，根据实际溶氧浓度差值与预设的第一标准溶氧浓度差值△c1’和第二标准溶氧浓度差值△c2’的关系所确定的第四速度调节系数α1’、第五速度调节系数α2’或是第六速度调节系数α3’对所述标准搅拌速度进行正向调节时，
8.根据权利要求7所述的痘苗病毒的高产培养方法，其特征在于，若调...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐迪华，陈彦平，余哲琪，
申请(专利权)人：深圳源兴基因技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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