【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及化合物生物技术及发酵工程技术生产领域，尤其是一种对香豆酸生产菌株及其构建方法与应用。
技术介绍
1、对香豆酸 (p-coumaric acid)，又名对羟基肉桂酸，在植物中广泛存在，是一种天然酚类化合物，具有抗氧化、抗炎和预防心血管疾病的作用，是很多重要化合物的前体。
2、目前对香豆酸合成方法主要为植物提取法、化学合成法、酶催化法和微生物发酵法。植物提取法具有生长周期长、收益率低、受环境影响大、提取成本高等缺点；化学合成法存在能耗高、副产物多、产率低、高污染等问题；酶催化法是由酪氨酸解氨酶作为关键酶催化酪氨酸底物生成对香豆酸，此方法对环境污染少，反应条件温和，但在催化过程中需要添加酪氨酸底物，大大增加了生产成本；微生物发酵法是以葡萄糖作为微生物生长的能量来源，微生物从头合成对香豆酸，无需添加底物，减少了生产成本，发酵过程条件温和，具有工业化生产的潜力，然而现阶段，对香豆酸的生物合成途径中，尚无法通过大肠杆菌高产量从头合成对香豆酸。
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种对香豆酸生产菌株。
2、本专利技术所要解决的另一技术问题在于提供上述对香豆酸生产菌株的构建方法。
3、本专利技术所要解决的另一技术问题在于提供上述对香豆酸生产菌株的应用。
4、为解决上述技术问题，本专利技术的技术方案是：
5、一种对香豆酸生产菌株，为菌株zg08，是利用代谢工程手段在出发菌株 e.
6、在 e.coliw3110基因组上敲除 csra基因，使其不表达，
7、在 yeel假基因位点使用ptrc启动子控制 tyrb基因过表达，
8、在 yciq假基因位点使用ptrc启动子控制 tyra fbr基因过表达，
9、在 mbha假基因位点使用ptrc启动子控制 aroe基因过表达，
10、在 ygay假基因位点使用ptrc启动子控制 arog fbr基因过表达，
11、在 ycdn假基因位点使用ptrc启动子控制 rgtal基因过表达，
12、在 rph假基因位点使用ptrc启动子控制 t7 rnap基因过表达，
13、在petx02质粒上使用t7启动子控制 rgtal基因过表达,
14、所述petx01质粒具有pet-28a(+)质粒载体部分特征，并在原质粒的基础上敲除了 laci基因。
15、优选的，上述对香豆酸生产菌株，所述代谢工程手段为crispr-cas9基因编辑技术。
16、优选的，上述对香豆酸生产菌株，所述出发菌株 e.coliw3110的保藏号为atcc273250。
17、优选的，上述对香豆酸生产菌株，所述ptrc启动子的核苷酸序列如序列表seq idno.1所示。
18、优选的，上述对香豆酸生产菌株，所述 csra基因的核苷酸序列如序列表seq idno.2所示。
19、优选的，上述对香豆酸生产菌株，所述 tyrb基因的核苷酸序列如序列表seq idno.3所示。
20、优选的，上述对香豆酸生产菌株，所述 tyra fbr基因的核苷酸序列如序列表seq idno.4所示。
21、优选的，上述对香豆酸生产菌株，所述 aroe基因的核苷酸序列如序列表seq idno.5所示。
22、优选的，上述对香豆酸生产菌株，所述 arog fbr基因的核苷酸序列如序列表seq idno.6所示。
23、优选的，上述对香豆酸生产菌株，所述 rgtal基因的核苷酸序列如序列表seq idno.7所示。
24、优选的，上述对香豆酸生产菌株，所述t7 rnap基因的核苷酸序列如序列表seq idno.8所示。
25、优选的，上述对香豆酸生产菌株，所述t7启动子的核苷酸序列如序列表seq idno.9所示。
26、优选的，上述对香豆酸生产菌株，所述petx01质粒的碱基序列如序列表seq idno.10所示。
27、上述对香豆酸生产菌株的构建方法，在出发菌株 e.coliw3110基础上进行定向改造，具体步骤如下：
28、（1）在出发菌株 e.coliw3110基因组上敲除 csra基因得到菌株zg01；
29、（2）以菌株zg01为出发菌株，在 yeel假基因位点使用ptrc启动子控制 tyrb基因过表达得到菌株zg02；
30、（3）以菌株zg02为出发菌株，在 yciq假基因位点使用ptrc启动子控制 tyra fbr基因过表达得到菌株zg03； ...
【技术保护点】
1.一种对香豆酸生产菌株，其特征在于：是利用代谢工程手段在出发菌株E.coliW3110的基础上进行进一步改造获得的，对csrA、tyrB、tyrAfbr、aroE、aroGfbr基因的表达强度进行调整，对T7 RNAP进行异源表达，对关键酶基因RgTal进行异源表达，构建表达RgTal基因的PETX02质粒，具体为：
2.根据权利要求1所述的对香豆酸生产菌株，其特征在于：所述出发菌株E.coliW3110的保藏号为ATCC 273250。
3.根据权利要求1所述的对香豆酸生产菌株，其特征在于：所述Ptrc启动子的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示；所述T7启动子的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.9所示。
4.根据权利要求1所述的对香豆酸生产菌株，其特征在于：所述csrA基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示；所述tyrB基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示；所述tyrAfbr基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.4所示；所述aroE基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.5所示；所述aroG
5.根据权利要求1所述的对香豆酸生产菌株，其特征在于：所述PETX01质粒的碱基序列如序列表SEQ ID NO.10所示。
6.权利要求1-5之一所述对香豆酸生产菌株的构建方法，其特征在于：在出发菌株E.coliW3110基础上进行定向改造，具体步骤如下：
7.权利要求1-5之一所述对香豆酸生产菌株在发酵生产对香豆酸方面的应用。
8.根据权利要求7所述对香豆酸生产菌株的应用，其特征在于：使用机械搅拌式发酵罐，具体步骤如下：
9.根据权利要求8所述对香豆酸生产菌株的应用，其特征在于：所述种子培养中采用的种子培养基：葡萄糖30g/L，酵母5g/L，蛋白胨3g/L，(NH4)2SO4 1g/L，KH2PO4 2g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，柠檬酸3g/L，谷氨酸 3g/L，其余为水；所述发酵培养中采用的发酵培养基：葡萄糖15g/L，酵母粉6g/L，蛋白胨2g/L，柠檬酸 3g/L，(NH4)2SO41.5g/L，KH2PO44g/L，MgSO4·7H2O 2g/L，谷氨酸3g/L，MnSO4·H2O 10mg/L，FeSO4·7H2O 20mg/L，其余为水。
10.根据权利要求8所述对香豆酸生产菌株的应用，其特征在于：在进行发酵培养时，随葡萄糖溶液流加PLP和氯化胆碱，每升80%葡萄糖溶液中添加9mgPLP与2.25g氯化胆碱。
...【技术特征摘要】
1.一种对香豆酸生产菌株，其特征在于：是利用代谢工程手段在出发菌株e.coliw3110的基础上进行进一步改造获得的，对csra、tyrb、tyrafbr、aroe、arogfbr基因的表达强度进行调整，对t7 rnap进行异源表达，对关键酶基因rgtal进行异源表达，构建表达rgtal基因的petx02质粒，具体为：
2.根据权利要求1所述的对香豆酸生产菌株，其特征在于：所述出发菌株e.coliw3110的保藏号为atcc 273250。
3.根据权利要求1所述的对香豆酸生产菌株，其特征在于：所述ptrc启动子的核苷酸序列如序列表seq id no.1所示；所述t7启动子的核苷酸序列如序列表seq id no.9所示。
4.根据权利要求1所述的对香豆酸生产菌株，其特征在于：所述csra基因的核苷酸序列如序列表seq id no.2所示；所述tyrb基因的核苷酸序列如序列表seq id no.3所示；所述tyrafbr基因的核苷酸序列如序列表seq id no.4所示；所述aroe基因的核苷酸序列如序列表seq id no.5所示；所述arogfbr基因的核苷酸序列如序列表seq id no.6所示；所述rgtal基因的核苷酸序列如序列表seq id no.7所示；所述t7 rnap基因的核苷酸序列如序列表seq id no.8所示。
5.根...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐庆阳，肖志刚，马零，陈志超，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：
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