纯化的肠道病毒的组合物和使用谷胱甘肽亲和色谱的纯化方法技术

本发明专利技术涉及纯化的肠道病毒的组合物、其药物组合物和用于纯化肠道病毒的谷胱甘肽亲和色谱方法。色谱方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】纯化的肠道病毒的组合物和使用谷胱甘肽亲和色谱的纯化方法
专利

[0001]本专利技术涉及纯化的肠道病毒的组合物和用于纯化肠道病毒的谷胱甘肽亲和色谱方法。
[0002]电子提交的序列表的引用
[0003]本申请的序列表经由EFS
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SEQLIST
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[0004]专利技术背景
[0005]小核糖核酸病毒科的肠道病毒属是小型、无包膜、单链正义RNA病毒，其含有几种人类病原体，包括脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、埃可病毒、编号肠道病毒和鼻病毒[1]。除了充分研究的脊髓灰质炎病毒之外，已经涌现针对非脊髓灰质炎肠道病毒引起的疾病的疫苗和治疗剂的开发研究，所述非脊髓灰质炎肠道病毒例如EV
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A71(手足口病)[2]、EV
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D68(呼吸系统疾病)和柯萨奇病毒A24(急性出血性结膜炎)[3]。肠道病毒也已被评估用作溶瘤病毒免疫疗法[4]。来自野生型菌株的柯萨奇病毒A21(CVA21)由于其选择性感染和对过表达细胞表面受体ICAM
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1的肿瘤的溶瘤作用，目前正在作为多种类型癌症的治疗在1b/2期临床试验中进行评估[5]。
[0006]对肠道病毒病毒疫苗和免疫疗法的不断增加的需求可能挑战常规生产平台。梯度超速离心通常用于富集完整的、含有基因组的衣壳和杂质清除，但是由于其低通量和劳动密集型方案，可能是纯化过程中的潜在瓶颈[6](图1A)。如重组腺相关病毒基因疗法纯化平台所证明的，从梯度超速离心向基于色谱的方法的转变可以提高可扩展性和生产率[7]。尚未证明色谱技术用于空(缺乏基因组；产物杂质)和完整(含有基因组；靶标产物)的肠道病毒颗粒分离。仍然需要基于色谱的梯度超速离心的替代方案，其能够除去空衣壳和污染杂质，以产生感染性的成熟病毒体的纯化组合物。这将使得肠道病毒纯化方法更适合于大规模工业生产。
[0007]专利技术简述
[0008]本专利技术提供纯化的CVA 21的组合物，其中基因组与感染性的比率小于约5000基因组/pfu；所述颗粒与感染性的比率小于约5000个颗粒/pfu；通过反相HPLC或UPLC测量的，VP0与VP2的比率小于约0.01；或通过CE
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SDS测量的，总VP1+VP2+VP3+VP4峰面积/总峰面积为至少95％。本专利技术还提供包含上述纯化的组合物的药物组合物。本专利技术还提供通过施用本专利技术的药物组合物治疗癌症的方法。另一方面，本专利技术提供谷胱甘肽亲和色谱从一种或多种杂质中纯化肠道病毒的用途。在一个实施方案中，所述方法从感染的宿主细胞培养收获物中选择性捕获和富集含有基因组的完全成熟肠道病毒病毒体，从而除去一种或多种杂质，例如非感染性基因组缺乏的肠道病毒原衣壳、宿主细胞蛋白(HCP)、宿主细胞DNA(HC
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DNA)和培养基相关杂质，例如牛血清白蛋白(BSA)。本专利技术还包括阴离子交换色谱从一种或多种杂质中纯化肠道病毒的用途。
[0009]附图简述
[0010]本专利技术的前述和其他目的、特征和优点将根据如附图中所示的本专利技术的各种实施方案的以下更具体的说明变得显而易见。
[0011]图1A
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B：A：梯度超速离心过程的描述。首先浓缩澄清的细胞培养收获物以减少体积。在超速离心管中制备梯度，且将样品加载到顶部。在离心之后，将梯度分级，并合并所选择的级分。将合并的级分透析以除去梯度溶液。B：GSH亲和色谱过程的描述。将澄清的细胞培养收获物直接加载到GSH亲和柱上。洗涤柱以除去杂质并洗脱纯化的病毒。柱可以再生以备将来使用。
[0012]图2：肠道病毒形态发生和组装。由VP0+VP1+VP3组成的五个原聚体组装形成五聚体。空的原衣壳可以由游离五聚体的可逆组装形成。在12个五聚体在复制细胞器上缩合并衣壳化(encapsidate)新合成的基因组以形成原病毒体之后，VP0自催化切割以形成VP4+VP2，并且形成成熟的病毒体。成熟病毒体是唯一含有VP4的颗粒并且能够是感染性的，但是并非所有成熟病毒体都是感染性的。成熟病毒体可降解成A颗粒和A颗粒的空衣壳。改编自[10]。
[0013]图3：使用Akta Pure进行GSH亲和色谱色谱图操作且使用CVA21通过UNICORN软件进行分析的的示例性色谱。对于以mL计的GSH亲和色谱操作体积，在280nm处的吸光度(UV 1_280，实线)迹线以mAU计，且电导率(Cond，虚线)迹线以mS/cm计。上图表示全色谱图。在上图的虚线框内描绘的下图表示洗涤、洗脱和洗提步骤。
[0014]图4：对使用CVA21的GSH亲和色谱法的银染的还原性12％丙烯酰胺Bis
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Tris SDS
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PAGE。在GSH流过(GSH FT)和洗涤(GSH W1
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2)步骤中清除澄清收获物中的宿主细胞和培养基杂质。CVA21以高浓度和纯度(检测到痕量BSA)洗脱，仅观察到VP1
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VP2
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VP3病毒衣壳条带(VP4(7kDa)从凝胶上洗脱)和最小VP0。将GSH洗脱(GSH洗脱)样品与梯度超速离心纯化(UC纯)的CVA21进行比较。
[0015]图5：使用毛细管电泳定量western印迹(Protein Simple)对CVA21澄清收获物和GSH色谱流过(GSH FT)和洗脱(GSH洗脱)样品与超速离心纯化材料(UC纯)的相对比较。通过抗VP1多克隆抗体(pAb)检测总衣壳颗粒，并用抗VP4 pAb检测VP0/VP4信号比。具有高VP0/VP4比率的颗粒(大量含VP0的颗粒：空原衣壳、原病毒体、五聚体、原聚体)流过GSH色谱柱，而具有低VP0/VP4比率的病毒颗粒(大量含VP4的颗粒：仅成熟病毒体)从GSH色谱柱洗脱。与UC纯相比，GSH洗脱导致VP0/VP4比率降低10倍，表明成熟病毒颗粒纯度高。
[0016]图6A
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B：GSH亲和洗脱的蔗糖梯度表征。将1mL的样品加载至15
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42％w/v蔗糖梯度，并以230,000g旋转100min。取出12
×
1mL级分，空衣壳(原衣壳或降解的A颗粒)预期在级分5
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8中，并且全衣壳(成熟病毒体或原病毒体)预期在级分9
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12中。6A：对GSH亲和色谱纯化洗脱液的银染的还原性12％丙烯酰胺bis
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Tris SDS
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PAGE。可检测到病毒蛋白条带VP1
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VP2
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VP3(VP4未显示)，没有检测到VP0和空衣壳。6B：使用毛细管电泳定量western印迹(Protein 本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种组合物，其包含纯化的柯萨奇病毒A 21(CVA21)，所述柯萨奇病毒A 21包含VP0、VP1、VP2、VP3、VP4和CVA21 RNA，其中VP0与VP2的比率小于约0.01。2.权利要求1的组合物，其中VP0与VP2的比率为约0.0005
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0.005。3.权利要求1的组合物，其中VP0与VP2的比率为约0.001
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0.003。4.一种包含纯化的CVA21的组合物，其中基因组与感染性的比率小于约5000基因组/pfu。5.权利要求4的组合物，其中所述基因组与感染性的比率为约200
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2000基因组/pfu。6.权利要求4的组合物，其中所述基因组与感染性的比率为约200
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800基因组/pfu。7.一种包含纯化的CVA21的组合物，其中颗粒与感染性的比率小于约5000颗粒/pfu。8.权利要求7的组合物，其中所述颗粒与感染性的比率为约200
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2000颗粒/pfu。9.权利要求7的组合物，其中所述颗粒与感染性的比率为约200
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600颗粒/pfu。10.权利要求1
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9中任一项的组合物，其中总VP1+VP2+VP3+VP4峰面积/总峰面积为至少95％。11.权利要求1
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10中任一项的组合物，其中所述组合物中宿主细胞DNA的量小于约10,000pg/剂量，每个剂量具有约5E7 pfu CVA21。12.权利要求1
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10中任一项的组合物，其中所述组合物中宿主细胞DNA的量为约0.05
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10pg/剂量，每个剂量具有约5E7 pfu CVA21。13.权利要求1
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12中任一项的组合物，其中所述组合物中牛血清白蛋白的量小于约50,000pg/剂量，每个剂量具有约5E7 pfu CVA21。14.权利要求1
‑
12中任一项的组合物，其中所述组合物中牛血清白蛋白的量为约50
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150pg/剂量，每个剂量具有约5E7 pfu CVA21。15.权利要求1
‑
14中任一项的组合物，其中所述CVA21包含SEQ ID NO：1中的核苷酸序列。16.权利要求1
‑
15中任一项的组合物，其中所述组合物具有1E5至1E12 TCID
50
/ml或pfu/ml的效力。17.一种药物组合物，其包含权利要求1
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16中任一项的组合物和可药用赋形剂。18.权利要求17的药物组合物，其用于治疗患者的癌症，其中将所述药物组合物以每次治疗多至约3E8 TCID
50
或5E7 pfu的剂量肿瘤内施用于所述患者。19.权利要求18的药物组合物，其中所述剂量为每次治疗约3E7至约3E8 TCID
50
或约5E6至约5E7 pfu的所述药物组合物。20.权利要求17的药物组合物，其用于治疗患者的癌症，其中将所述药物组合物的剂量为每次治疗约1E9 TCID
50
或1.5E8 pfu。21.一种纯化肠道病毒的方法，所述方法包括以下步骤：(a)使用加载溶液将肠道病毒与固定相结合，其中谷胱甘肽固定在所述固定相上；(b)用洗脱溶液从所述固定相洗脱所述肠道病毒。22.权利要求21的方法，其中在步骤(a)之前，用平衡溶液平衡所述固定相。23.权利要求21或22的方法，还包括在步骤(a)之后且在步骤(b)之前用一种或多种洗涤溶液洗涤所述固定相的步骤(i)。24.权利要求23的方法，其中步骤(i)包括使用洗涤溶液的第一洗涤步骤，所述洗涤溶
液的电导率高于平衡溶液或加载溶液。25.权利要求24的方法，其中步骤(i)包括使用洗涤溶液的第二洗涤步骤，所述洗涤溶液的电导率低于第一洗涤步骤中的洗涤溶液。26.权利要求25的方法，其中洗脱溶液的电导率与所述第二洗涤步骤中的洗涤溶液相同。27.权利要求21
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26中任一...

【专利技术属性】
技术研发人员：E，
申请(专利权)人：默沙东有限公司，
类型：发明
国别省市：