一种稀释法传代纯化腮腺炎病毒的方法技术

本发明专利技术公开一种稀释法传代纯化腮腺炎病毒的方法，属于减毒活疫苗技术领域。包括以下步骤：将腮腺炎病毒母液逐级稀释至10

【技术实现步骤摘要】
一种稀释法传代纯化腮腺炎病毒的方法


[0001]本专利技术属于减毒活疫苗
，具体是一种稀释法传代纯化腮腺炎病毒的方法。

技术介绍

[0002]疫苗的研发和生产过程中，尤其是减毒活疫苗类产品，毒种的质量是尤为关键的，例如水痘、腮腺炎、麻疹等疫苗，其病毒种子均为经过连续传减毒制备而成，由于毒种的分离培养、种子库的建立历史比较长，工艺比较传统，造成了部分毒种在活性方面不是特别的理想。现有毒种纯化暂无特定的方法，无相关科学系统的试验研究。

技术实现思路

[0003]为解决上述技术问题，本专利技术提供一种稀释法传代纯化腮腺炎病毒的方法。
[0004]为实现上述专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0005]一种稀释法传代纯化腮腺炎病毒的方法，所述方法包括以下步骤：
[0006](1)取腮腺炎病毒母液，将腮腺炎病毒母液逐级稀释至10
‑1～10
‑9稀释度；
[0007](2)将步骤(1)获得的10
‑5～10
‑9稀释度的病毒溶液分别接种至细胞基质；
[0008](3)置于32～37.0℃条件下培养，收获出现细胞融合病变的病毒培养上清液，检定病毒滴度；
[0009](4)将步骤(3)收获的病毒再次逐级稀释至10
‑1～10
‑9稀释度；
[0010](5)置于32～37.0℃条件下培养，收获出现明显细胞融合病变的病毒培养上清液，检定病毒滴度；
[0011](6)若病毒滴度低于6.5lgCCID
50
/ml，重复步骤(1)～(5)的操作步骤，直至获得高质量的病毒种子。
[0012]基于以上技术方案，进一步地，步骤(2)中所述的细胞基质为原代鸡胚细胞。
[0013]基于以上技术方案，进一步地，所述的原代鸡胚细胞的制备步骤为：孵化SPF种蛋，取9～11日龄鸡胚，消毒后，解剖采集胚体，剪碎，加入胰酶溶液消化至蓬松透明状，用吸管反复吹打，过滤，收集滤液获得细胞悬液，将细胞悬液接种至T25细胞培养瓶，于36.5℃条件下静置培养48小时左右，待细胞长至单层，得到单层鸡胚细胞。
[0014]基于以上技术方案，进一步地，步骤(2)中的培养体系中添加有病毒生长液，为含新生牛血清、水解乳蛋白的Earle
’
s培养液，并调节病毒生长液pH为7.20～7.40。
[0015]基于以上技术方案，进一步地，步骤(2)中培养过程中，每隔6小时观察一次细胞是否病变。
[0016]基于以上技术方案，进一步地，所述步骤(2)中用于接种的病毒的稀释度为10
‑7、10
‑8、10
‑9。
[0017]本专利技术另一方面提供上述的一种稀释法传代纯化腮腺炎病毒的方法制备获得的高病毒滴度、高稳定性的腮腺炎病毒。
[0018]本专利技术相对于现有技术具有的有益效果如下：
[0019]本专利技术的稀释法传代纯化腮腺炎病毒的方法纯化后的腮腺炎病毒种子，病毒滴度显著提高，稳定性良好，基因没有发生改变，对提升减毒活疫苗的质量成效显著。
具体实施方式
[0020]下面结合实施例对本专利技术进行详细的说明，但本专利技术的实施方式不限于此，显而易见地，下面描述中的实施例仅是本专利技术的部分实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，获得其他的类似的实施例均落入本专利技术的保护范围。
[0021]实施例1
[0022]一种稀释法传代纯化腮腺炎病毒的方法，主要包括以下步骤：
[0023](1)细胞制备：
[0024]孵化SPF种蛋，取9～11日龄鸡胚，消毒后，解剖采集胚体，剪碎，加入胰酶溶液消化至蓬松透明状，用吸管反复吹打，过滤，收集滤液获得细胞悬液，将细胞悬液接种至T25细胞培养瓶，于36.5℃条件下静置培养48小时左右，待细胞长至单层，得到单层鸡胚细胞，用于病毒接种。
[0025](2)病毒稀释
[0026]将腮腺炎病毒(购买于ATCC)进行梯度稀释，稀释剂为含新生牛血清、0.2％水解乳蛋白的Earle
’
s液，稀释梯度为10
‑1、10
‑2、10
‑3、10
‑4、10
‑5、10
‑6、10
‑7、10
‑8、10
‑9。其中稀释剂具体成分为：新生牛血清、0.2％水解乳蛋白、Earle
’
s液、谷氨酰胺溶液和碳酸氢钠溶液的含量分别为5％，1％，91％，1％，2％，配制方法为：向Earle
’
s液内依次加入新生牛血清、0.2％水解乳蛋白，谷氨酰胺溶液、碳酸氢钠溶液，混匀。
[0027](3)病毒接种
[0028]将10
‑7、10
‑8、10
‑9稀释度的病毒稀释液分别接种至步骤(1)制备的单层鸡胚细胞，培养体系中添加有病毒生长液，病毒生长液为含新生牛血清、水解乳蛋白的Earle
’
s培养液，向病毒生长液内加入碳酸氢钠溶液，调节pH值，使其在7.20～7.40范围内。病毒生长液的具体成分为：新生牛血清、0.2％水解乳蛋白、Earle
’
s液、谷氨酰胺溶液、碳酸氢钠溶液的含量分别为2％，1％，94％，1％，2％，配制方法为向Earle
’
s液内依次加入：新生牛血清、0.2％水解乳蛋白，谷氨酰胺溶液、碳酸氢钠溶液，混匀。
[0029](4)病毒培养
[0030]将接种后的细胞放置于33.5℃恒温箱中静置培养。
[0031](5)病毒收获
[0032]每隔6小时观察细胞病变，待细胞出现融合病变后，收获出现细胞融合病变的病毒培养上清液，取样检测病毒滴度；未出现病变的稀释度废弃处理。
[0033](6)二次稀释与病毒培养
[0034]将收获的病毒溶液二次梯度稀释，稀释剂为含新生牛血清、水解乳蛋白的Earle
’
s液，稀释梯度为10
‑1、10
‑2、10
‑3、10
‑4、10
‑5、10
‑6、10
‑7、10
‑8、10
‑9。按照步骤(2)～(5)继续培养扩增1代。
[0035](7)重复上述操作，连续稀释、培养2～3次，至细胞出现明显融合病变，收获病毒进行保存，此病毒收获物可作为毒种制备的原始种子，用于主种子库和工作种子库的制备。
[0036]上述稀释法传代纯化腮腺炎病毒过程中每次纯化后均进行病毒滴度检测，检测结果见下表：
[0037]表1.病毒母液与病毒种子收获液的病毒滴度检测结果
[0038]样品名称病毒滴度(lgCCID
50
/ml)一次纯化后腮腺炎病毒种子6.000二次纯化后腮腺炎病毒种子6.125三次纯化后腮腺炎病毒种子6.500未经纯化的腮腺炎病毒种子6.000
[0039]由上表可以看出，稀释纯化本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种稀释法传代纯化腮腺炎病毒的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)取腮腺炎病毒母液，将腮腺炎病毒母液逐级稀释至10
‑1～10
‑9稀释度；(2)将步骤(1)获得的10
‑5～10
‑9稀释度的病毒溶液分别接种至细胞基质；(3)置于32～37.0℃条件下培养，收获出现细胞融合病变的病毒培养上清液，检定病毒滴度；(4)将步骤(3)收获的病毒再次逐级稀释至10
‑1～10
‑9稀释度；(5)置于32～37.0℃条件下培养，收获出现明显细胞融合病变的病毒培养上清液，检定病毒滴度；(6)若病毒滴度低于6.5lgCCID
50
/ml，重复步骤(1)～(5)的操作步骤，直至获得高质量的病毒种子。2.根据权利要求1所述的一种稀释法传代纯化腮腺炎病毒的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的细胞基质为原代鸡胚细胞。3.根据权利要求2所述的一种稀释法传代纯化腮腺炎病毒的方法，其特征在于，所述的原代鸡胚细胞的制备步骤为：孵化SPF种蛋...

【专利技术属性】
技术研发人员：沙雪艳，王贵强，杨利伟，
申请(专利权)人：科兴大连疫苗技术有限公司，
类型：发明
国别省市：