使用离子浓度提高重组腺相关病毒的包装效率制造技术

本发明专利技术涉及提高重组腺相关病毒(rAAV)的包装效率，以提高其生产滴度的方法。更具体地，本发明专利技术涉及通过施用另外的离子提高细胞培养基的离子强度，以提高转染细胞的rAAV生产滴度的方法。的方法。的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】J.Virol.76(16):8225
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8235)。AAV基因组的3
’
半包括AAV衣壳基因(cap)，该基因编码三种衣壳蛋白(VP)：VP1、VP2和VP3。这三种衣壳蛋白从由单个启动子(在AAV2的情况下，p40)控制的单独的mRNA转录物翻译而来的。AAV基因组的3
’
半还包括AAP基因，该基因编码AAV组装活化蛋白(AAP)。六十个VP单体(包括大约VP1的5个副本、VP2的5个副本和VP3的50个副本)在AAV基因组周围自组装以形成成熟病毒颗粒的二十面体蛋白质壳(衣壳)(B
ü
ning,H.et al.(2019)“Capsid Modifications for Targeting and Improving the Efficacy of AAV Vectors,”Mol.Ther.Meth.Clin.Devel.12:P248
‑
P265；Van Vliet K.M.et al.(2008)The Role of the Adeno
‑
Associated Virus Capsid in Gene Transfer.In:Drug Delivery Systems,Jain,K.K.(eds.),Meth.Molec.Biol.437:51
‑
91)。AAV AAP蛋白质被认为是稳定和将新产生的VP蛋白质从细胞质运输到细胞核中所需要的。AAV基因组的3
’
半还包括AAV X基因，该基因被认为编码支持基因复制的蛋白质(Colella,P.et al.(2018)“Emerging Issues in AAV
‑
Mediated In Vivo Gene Therapy,”Molec.Ther.Meth.Clin.Develop.8:87
‑
104；B
ü
ning,H.et al.(2019)“Capsid Modifications for Targeting and Improving the Efficacy of AAV Vectors,”Mol.Ther.Meth.Clin.Devel.12:P248
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P265；Cao,M.et al.(2014)“The X Gene Of Adeno
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Associated Virus 2(AAV2)Is Involved In Viral DNA Replication,”PLoS ONE 9,e104596:1
‑
10)。
[0006]上述AAV基因编码序列的两侧是145个核苷酸的两个AAV特异性的回文反向重复序列(ITR)(Balakrishnan,B.et al.(2014)“Basic Biology of Adeno
‑
Associated Virus(AAV)Vectors Used in Gene Therapy,”Curr.Gene Ther.14(2):86
‑
100；Colella,P.et al.(2018)“Emerging Issues in AAV
‑
Mediated In Vivo Gene Therapy,”Molec.Ther.Meth.Clin.Develop.8:87
‑
104)。
[0007]AAV是一种天生有缺陷的病毒，缺乏执行以下至少两种至关重要的功能的能力：启动病毒特异性产物合成的能力和组装这种产物以形成成熟的感染性病毒颗粒的十二面体蛋白质壳(衣壳)的能力。因此，AAV需要共感染“辅助(helper)”病毒，例如腺病毒(Ad)、单纯疱疹病毒(HSV)、巨细胞病毒(CMV)、牛痘病毒或人乳头瘤病毒以提供病毒相关RNA，该RNA不是由AAV基因组的基因编码的。这种VA RNA没有进行翻译，但在调节其他病毒基因的翻译方面发挥作用。类似地，AAV基因组不包括编码Ad的病毒蛋白E1a、E1b、E2a和E4的基因；因此，这些蛋白还必须由共感染“辅助”病毒提供。E1a蛋白极大地促进了在增殖性感染过程中的病毒基因转录。E1b蛋白阻断了在腺病毒感染的细胞中的凋亡，因此允许增殖性感染继续进行。E2a蛋白通过展开模板和增强转录的启动，在病毒链置换复制的伸长阶段发挥作用。E4蛋白已被证明会影响转基因持久性、载体毒性和免疫原性(参见Grieger,J.C.et al.(2012)“Adeno
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Associated Virus Vectorology,Manufacturing,and Clinical Applications,”Meth.Enzymol.507:229 254；Dyson,N.et al.(1992)“Adenovirus E1A Targets Key Regulators Of Cell Proliferation,”Canc.Surv.12:161
‑
195；Jones N.C.(1990)“Transformation By The Human Adenoviruses,”Semin.Cancer Biol.1(6):425
‑
435；Ben
‑
Israel,H.et al.(2002)“Adenovirus and Cell Cycle Control,”Front.Biosci.7:D1369
‑
d1395；Hoeben,R.C.et al.(2013)“Adenovirus DNA Replication,”Cold Spring Harb.Perspect.Biol.5:a013003(pages 1
‑
11)；Berk,A.J.
AAV
‑
Mediated In Vivo Gene Therapy,”Molec.Ther.Meth.Clin.Develop.8:87
‑
104；B
ü
ning,H.et al.(2019)“Capsid Modifications for Targeting and Improving the Efficacy of AAV Vectors,”Mol.Ther.Meth.Clin.Devel.12:P248
‑
P265)。因此，在5
’
至3
’
方向，rAAV包括5
’
ITR、rAAV的转基因表达盒和3
’
ITR。
[0011]rAAV已被用于向患有大量基因疾病(例如，遗传性脂蛋白脂酶缺乏症(LPLD)、莱伯氏先天性黑蒙症(LCA)、芳香族L
‑
胺基酸类脱羧基酶缺乏症(AADC)、无脉络膜症和血友病)中的任一种的患者递送转基因，并且在新型临床形式中具有效用，例如RNA干扰(RNAi)治疗和基因修饰策略，例如Crispr/本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种提高重组修饰腺相关病毒(rAAV)的生产滴度的方法，其中所述方法包括以下步骤：(A)在足以允许生产rAAV的条件下，将用所述rAAV转染的细胞在初始培养基中培养初始时间，其中所述细胞还含有AAV辅助功能提供多核苷酸和非AAV辅助功能提供多核苷酸；(B)在所述初始时间之后，通过向所述培养基中添加除Na
+
之外的一种或多种离子来改变所述培养基的离子强度；以及(C)继续所述细胞的所述培养，从而产生比在没有步骤(B)的情况下获得的滴度更大的所述rAAV的生产滴度。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述添加的离子中的每种以足以使所述初始培养基中的这种离子的浓度增加约10mM至约80mM的含量提供。3.根据权利要求1或2中任一项所述的方法，其中生产滴度比在没有所述步骤(B)的情况下类似地进行细胞培养得到的滴度大至少50％。4.根据权利要求1
‑
3中任一项所述的方法，其中所述rAAV包括编码蛋白质的转基因盒，或包括转录核酸，其对基因或可遗传性疾病或病况具有治疗作用。5.根据权利要求1
‑
4中任一项所述的方法，其中所述rAAV属于rAAV1、rAAV2、rAAV5、rAAV6、rAAV7、rAAV8、rAAV9或rAAV10血清型或属于所述血清型的杂交型。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述rAAV属于rAAV2、rAAV5或rAAV9血清型或属于所述血清型的杂交型。7.根据权利要求1
‑
6中任一项所述的方法，其中所述添加的离子包括K
+
、Ca
++
或Mg
++
中的一种或多种。8.根据权利要求1
‑
7中任一项所述的方法，其中所述添加的离子包括CO
3＝
、HCO3–
、HPO4–
、PO
4＝
、SCN
–
、SO
4＝
、HSO4–
和Cl
–<...

【专利技术属性】
技术研发人员：王启钊，
申请(专利权)人：查尔斯河实验室股份有限公司，
类型：发明
国别省市：