一种慢病毒的纯化方法技术

本发明专利技术涉及一种慢病毒的纯化方法，该纯化方法是在纯化的浓缩过程中使用一定浓度的PEG(添加KCl或NaCl)按比例与病毒上清进行混合，离心，得到慢病毒沉淀；用PBS溶解，对获得的慢病毒悬液进行核酸酶Benzonase酶切处理；添加鱼精蛋白进行沉淀慢病毒，添加1mol/L NaCl溶解病毒，离心，得到初纯化的慢病毒悬液；再经过蔗糖密度梯度离心，获得纯化的慢病毒。本发明专利技术制得的慢病毒纯化液无外源因子污染，细胞宿主蛋白、宿主DNA残留度低，安全性好，纯度和滴度高，可达到动物实验及临床要求。可达到动物实验及临床要求。可达到动物实验及临床要求。

【技术实现步骤摘要】
一种慢病毒的纯化方法


[0001]本专利技术涉及一种慢病毒的纯化方法，属于病毒学


技术介绍

[0002]慢病毒属于逆转录病毒科，包括8种能够感染人和脊椎动物的病毒，原发感染的细胞以淋巴细胞和巨噬细胞为主，感染个体最终发病。慢病毒感染患者早期很难观察，大多经历长达数年的潜伏期，之后缓慢发病，因此称为慢病毒(Lentivirus)。慢病毒通常与免疫系统和中枢神经系统的慢性疾病有关，如人类免疫缺陷病毒(HIV)会导致艾滋病。慢病毒载体是以慢病毒基因组为基础，对其自身元件进行改造而发展起来的一类能够携带外源基因的病毒载体。
[0003]与其他病毒相比，慢病毒有其独特的优点：
[0004](1)宿主更广泛：对于分裂和非分裂细胞均具有感染能力，对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，能大大提高目的基因转导效率；
[0005](2)可稳定表达：慢病毒基因组可整合于宿主基因组，因此可以长时间、稳定表达外源基因；
[0006](3)可携带大约5kb或更长的外源基因片段：基于慢病毒载体的优点，其被广泛应用于RNAi、基因治疗以及转基因动物等研究中。体外构建能够表达siRNA的慢病毒载体，然后进行细胞转染，使其在细胞内转录siRNA，可发挥长期阻断基因表达的作用。同时，以慢病毒作为基因载体的多种基因疗法已在国内外开展临床研究，效果非常理想，在基因治疗中拥有广阔的应用前景。
[0007]当使用慢病毒载体感染细胞时，通常需要浓缩病毒颗粒以获得高滴度及高纯度的慢病毒，特别是需要感染大量细胞或者用于某些对转导具有抵抗力的细胞系时。离心除去细胞碎片及杂质是纯化慢病毒初级的简单有效的方法，在纯化过重中浓缩过程使用蔗糖及磷酸缓冲盐溶液的添加剂及切向流来辅助病毒的纯化。
[0008]目前获得高纯度慢病毒主要有三种方法：PEG沉淀法、超滤法和超离法。
[0009]PEG沉淀法：聚乙二醇(PEG)为水溶性非离子型聚合物，具有各种不同的分子量，用于沉淀病毒的主要分子量为2000
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6000的PEG，将PEG配成50％左右的溶液，或直接将固体PEG加于病毒悬液中，使其达到所需浓度，通常在4℃过夜，然后离心使病毒沉淀。
[0010]超滤法：采用超滤膜以压力差为推动动力的膜过滤方法为超滤膜过滤。超滤膜大多由醋酯纤维或与其性能类似的高分子材料制得，适用于处理溶液中溶质的分离和增浓。
[0011]超离法：物质在介质中沉降时还伴随有扩散现象。扩散是无条件的绝对的。扩散与物质的质量成反比，颗粒越小扩散越严重。而沉降是相对的，有条件的，要受到外力才能运动。沉降与物体重量成正比，颗粒越大沉降越快。对小于几微米的微粒如病毒或蛋白质等，它们在溶液中成胶体或半胶体状态，仅仅利用重力是不可能观察到沉降过程的。因为颗粒越小沉降越慢，而扩散现象则越严重。所以需要利用离心机产生强大的离心力，才能迫使这些微粒克服扩散产生沉降运动。
[0012]PEG可与病毒结合，形成多聚体，较低离心力即可获得病毒沉淀。利用超滤膜将水、盐及小分子滤过，将大分子或病毒等颗粒截留。超滤膜的孔径要比病毒颗粒小，只能去除比病毒小的细胞碎块。超速离心沉淀慢病毒仍然会有部分质粒DNA和宿主DNA的残留。因此，这些方法纯化得到的慢病毒纯度较低，进而限制了其应用范围。

技术实现思路

[0013]为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种慢病毒的纯化方法。本专利技术制得的慢病毒纯化液无外源因子污染，细胞宿主蛋白、宿主DNA残留度低，安全性好，纯度和滴度高，可达到动物实验及临床要求。
[0014]本专利技术的技术方案如下。
[0015]一种慢病毒的纯化方法，所述纯化方法包括以下步骤：
[0016](5)用PEG与病毒上清进行混合，离心，得到慢病毒沉淀；
[0017](6)用PBS溶解沉淀，对获得的慢病毒悬液进行核酸酶酶切处理；
[0018](7)添加鱼精蛋白沉淀慢病毒，溶解病毒，离心，得到初纯化的慢病毒悬液；
[0019](8)再经过蔗糖密度梯度离心，获得纯化的慢病毒。
[0020]进一步地，所述步骤(1)为：5X PEG按0.5
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2:1体积比与病毒上清进行混合，3
‑
5℃，沉淀1
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3h，每10
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30min将混合液颠倒混匀；3
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5℃，4000
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6000rpm，5
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15min离心病毒混合液，弃上清，得到白色的慢病毒沉淀；所述5X PEG中添加了KCl或NaCl。
[0021]更进一步地，所述步骤(1)具体为：5X PEG按0.5:1比例与病毒上清进行混合，4℃，沉淀2h，每20min将混合液颠倒混匀；4℃，5000rpm，10min离心病毒混合液，弃上清，得到白色的慢病毒沉淀；所述5X PEG中添加了1mol/L的KCl或NaCl。
[0022]进一步地，所述步骤(2)为：用10mL PBS溶解病毒沉淀，得到病毒溶液；在所述病毒溶液中添加1μL的核酸酶Benzonase酶进行酶切处理。
[0023]进一步地，所述步骤(3)为：添加0.5
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2mg/mL鱼精蛋白35
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40℃放置20
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40min，离心，得到初纯化的慢病毒沉淀。
[0024]更进一步地，所述步骤(3)具体为：添加1mg/mL鱼精蛋白37℃放置30min，10000rpm，4℃，离心10min，得到初纯化的慢病毒沉淀。
[0025]进一步地，所述步骤(4)具体为：依次在超速离心管底部加入2mL 70％，1mL 50％，1mL30％，4mL 20％蔗糖(v/w)浓度梯度溶液，20000rpm，4℃，离心2h；取30％
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50％的溶液，每1mL加10mL PBS混匀，得到病毒
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蔗糖
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PBS混合液；再取新的超速离心管，底部加入6mL20％蔗糖溶液，再加入病毒
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蔗糖
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PBS混合液，20000rpm，4℃，离心2h，弃掉上清，留下病毒沉淀，用1mL病毒保存液重悬病毒沉淀，4℃冰箱中1
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2h溶解病毒沉淀，0.5h混匀一次；10000rpm，10min离心，取上清。
[0026]进一步地，所述慢病毒的滴度用QPCR法检测。
[0027]本专利技术还提供了上述慢病毒的纯化方法在细胞感染中的应用。
[0028]本专利技术还提供了上述慢病毒的纯化方法在基因表达中的应用。
[0029]本专利技术的有益效果：
[0030]本专利技术提供了一种新慢病毒纯化的方法，使用一定浓度的PEG(添加KCl或NaCl)按比例与病毒上清进行混合，离心，得到慢病毒沉淀，用PBS溶解，对获得慢病毒悬液添加核酸
酶Benzonase酶(Benzonase核酸酶，或来自粘质沙雷氏菌的内切核酸酶本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种慢病毒的纯化方法，其特征在于，所述纯化方法包括以下步骤：(1)用PEG与病毒上清进行混合，离心，得到慢病毒沉淀；(2)用PBS溶解沉淀，对获得的慢病毒悬液进行核酸酶酶切处理；(3)添加鱼精蛋白沉淀慢病毒，溶解病毒，离心，得到初纯化的慢病毒悬液；(4)再经过蔗糖密度梯度离心，获得纯化的慢病毒。2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述步骤(1)为：5X PEG按0.5
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2:1体积比与病毒上清进行混合，3
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5℃，沉淀1
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3h，每10
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30min将混合液颠倒混匀；3
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5℃，4000
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6000rpm，5
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15min离心病毒混合液，弃上清，得到白色的慢病毒沉淀；所述5X PEG中添加了KCl或NaCl。3.根据权利要求1或2所述的纯化方法，其特征在于，所述步骤(1)具体为：5X PEG按0.5:1比例与病毒上清进行混合，4℃，沉淀2h，每20min将混合液颠倒混匀；4℃，5000rpm，10min离心病毒混合液，弃上清，得到白色的慢病毒沉淀。4.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述步骤(2)为：用10mL PBS溶解病毒沉淀，得到病毒溶液；在所述病毒溶液中添加1μL的核酸酶Benzonase酶进行酶切处理。5.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述步骤(3)为：添加0.5
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【专利技术属性】
技术研发人员：龙炎杏，胡清云，刘彩云，许澎，
申请(专利权)人：湖南丰晖生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：