一种慢病毒溶解缓冲液及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种慢病毒溶解缓冲液及其应用，其包括3

【技术实现步骤摘要】
一种慢病毒溶解缓冲液及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，特别是一种慢病毒溶解缓冲液及其应用。

技术介绍

[0002]慢病毒常用于嵌合抗原受体
‑
T细胞治疗(Chimeric Antigen Receptor T
‑
Cell Immunotherapy，CAR
‑
T)，其具有转导效率高、可整合T细胞基因组并持续表达目标蛋白等优势。现如今，CAR
‑
T生产大多基于慢病毒载体介导的CAR基因转移。然而，慢病毒是一种极其脆弱的病毒载体，在生产过程中的剪切力、挤压、温度、pH、离子强度以及操作处理时间等对其具有较大影响；此外，慢病毒还比较容易聚集，这对于慢病毒生产和储存造成较大挑战。
[0003]现有技术中，通常用于慢病毒溶解的缓冲液为PBS缓冲液、50 mM Tris缓冲液、PBS+4%乳糖缓冲液、DMEM+2%HSA缓冲液、HATM缓冲液或HSTM缓冲液，然而现有的缓冲液使用效果较差，无法为慢病毒提供较为适宜的溶解环境。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于针对
技术介绍
中所述的现有的慢病毒溶解的缓冲液使用效果较差，无法为慢病毒提供较为适宜的溶解环境的问题，提供一种能够解决前述问题的慢病毒溶解缓冲液。
[0005]为实现以上目的，本专利技术通过以下技术方案予以实现：慢病毒溶解缓冲液，其包括3
‑
10mM 的Tris、15
‑
35mM 的脯氨酸、1
‑/>5mM的MgCl2、5
‑
20%的乳糖、0.005%
‑
0.02%的 Tween80，其余为水，上述的百分比均为质量百分比，慢病毒溶解缓冲液的pH为7
‑
9。
[0006]作为上述慢病毒溶解缓冲液的进一步改进，还包括0.05%
‑
0.2 %的泊洛沙姆。通过添加泊洛沙姆能防止细胞或慢病毒受机械挤压而活性下降。
[0007]作为上述慢病毒溶解缓冲液的进一步改进，所述的泊洛沙姆为Poloxamer 188、P407或F108。通过选用Poloxamer 188、P407或F108三种泊洛沙姆，能进一步防止细胞或慢病毒受机械挤压而活性下降。
[0008]本专利技术的第二个专利技术目的在于提供一种上述方案中所述的慢病毒溶解缓冲液的应用，慢病毒溶解缓冲液能用于细胞治疗的慢病毒的纯化。
[0009]本专利技术的第三个专利技术目的在于提供一种试剂盒，包含上述权利要求1
‑
3中任意一项所述的慢病毒溶解缓冲液。
[0010]本专利技术的第四个专利技术目的在于提供一种利用上述方案中所述的慢病毒溶解缓冲液的慢病毒纯化方法，其特征在于：包括以下步骤：S1、使用悬浮细胞进行慢病毒包装；S2、离心收获含有慢病毒的上清液；S3、使用0.45 μm膜进行预过滤；S4、使用500 KD中空纤维浓缩5～10倍；S5、使用慢病毒溶解缓冲液以500 KD中空纤维进行洗滤，洗滤10个浓缩体积；
S6、洗滤结束，继续浓缩，使得总浓缩倍数15～25倍左右,并取样送测病毒感染滴度(FACS)。
[0011]S7、将感染复数MOI设置为1或3转导激活CD3+T细胞；S8、转导48 h后补加培养基至8 mL；S9、继续培养2～3天后进行CAR阳性率检测。
[0012]作为上述的慢病毒纯化方法的进一步改进，步骤S7中，转导细胞密度为1
×
10
6 cells/mL。
[0013]作为上述的慢病毒纯化方法的进一步改进，步骤S8中，添加的培养基为X
‑
Vivo 15+2%SR+200IU/mL IL
‑
2培养基。该培养基为Lonza公司、Thermo公司和北京四环生物制药有限公司生产的培养基，其中，X
‑
Vivo和SR均为细胞治疗领域符合GMP法规的CAR
‑
T生产原材料，IL
‑
2为药用级。
[0014]本专利技术的有益效果为：1）本专利技术的慢病毒溶解缓冲液的配方中不仅包括了Tris和乳糖，还包括了脯氨酸、MgCl2、Tween80，同时去除了现有技术中的缓冲液配方中的PBS和DMEM+2%HSA，并大幅度降低了Tris的使用量；且本专利技术的组分都是药用辅料，能避免对慢病毒活性的影响，2）专利技术人研究发现，在本专利技术的慢病毒缓冲液中添加脯氨酸能稳定病毒结构和增强病毒活性；Tween80也称为聚山梨酯80，是一种药用辅料，能够防止蛋白或病毒聚集；MgCl2是一种药用辅料，具有维持蛋白或病毒活性的作用，通过上述的配方中的几种组分的组合作用，能全面提升慢病毒纯化时的活性和回收率，并提高慢病毒的转导效率，在进行CAR
‑
T转导时，其CAR阳性率也明显较高；3）本专利技术的慢病毒溶解缓冲液的配方中的泊洛沙姆，如Poloxamer 188、P407或F108都为高分子化合物，具有防止细胞或病毒受物理剪切力的作用而受损，可以促进病毒与细胞结合，从而增强病毒感染细胞的能力。
附图说明
[0015]图1为对比例1中的四种含有慢病毒的缓冲液在4℃下存放0h、4 h、24 h、48 h后测出的FACS滴度图表。
[0016]图2为对比例1中的四种含有慢病毒的缓冲液在室温（25℃
±
5℃）下存放0h、4 h、24 h、48 h后测出的FACS滴度图表，因为在存放24h和48h后，FACS滴度值都低于检测限，所以在图中没有显示。
[0017]图3为对比例1中的四种含有慢病毒的缓冲液在37℃下存放0h、2 h、4 h、24 h后测出的FACS滴度图表，因为在存放24h后，FACS滴度值都低于检测限，所以在图中没有显示。
[0018]图4为对比例1中的四种含有慢病毒的缓冲液以
‑
80℃/37℃反复冻融0
‑
3次后测出的FACS滴度图表。
[0019]图5为对比例2中，感染复数为3时，采用PBS缓冲液、HSTM缓冲液、HATM缓冲液和TLTM缓冲液的慢病毒转导激活CD3+T细胞后检测的CAR阳性率图表。
[0020]图6为对比例3中，使用TLTM、TLTM1、TLTM7、TLTM8四种慢病毒溶解缓冲液后，得到的慢病毒的滴度和回收率的数据图表；图中柱形图代表慢病毒的FACS感染滴度，三角线代表慢病毒的回收率。
[0021]图7为对比例4中，感染复数为1和3时，使用TLTM、TLTM1、TLTM7、TLTM8四种慢病毒溶解缓冲液后，转导激活CD3+T细胞后检测的CAR阳性率的数据图表。
具体实施方式
[0022]下面通过实施例对本专利技术的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种慢病毒溶解缓冲液，其特征在于：其包括3
‑
10mM 的Tris、15
‑
35mM 的脯氨酸、1
‑
5mM的MgCl2、5
‑
20%的乳糖、0.005%
‑
0.02%的 Tween80，其余为水，上述的百分比均为质量百分比，慢病毒溶解缓冲液的pH为7
‑
9。2.根据权利要求1所述的慢病毒溶解缓冲液，其特征在于：还包括0.05%
‑
0.2 %的泊洛沙姆。3.根据权利要求2所述的慢病毒溶解缓冲液，其特征在于：所述的泊洛沙姆为Poloxamer 188、P407或F108。4.一种上述权利要求1
‑
3中任意一项所述的慢病毒溶解缓冲液的应用，其特征在于：用于细胞治疗的慢病毒的纯化。5.一种试剂盒，其特征在于：包含上述权利要求1
‑
3中任意一项所述的慢病毒溶解缓冲液。6.一种利用上述权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡迪超，皮川真，隋礼丽，孔令洁，
申请(专利权)人：苏州博腾生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：