mRNA的制备方法技术

本发明专利技术通过在DNA转录模板的启动子和目的基因之间设计限制性酶切位点，于体外转录体系中进行第一阶段转录反应，转录过程产物产量无明显产量上升后，加入对应的限制性内切酶进行第二阶段转录反应，切断所述线性DNA转录模板的启动子片段，使RNA聚合酶无法识别线性DNA转录模板，因此RNA聚合酶无法与线性DNA转录模板结合，即不再启动新的转录，大部分的未转录完成的mRNA序列片段继续延伸完成转录，可转录成完整的mRNA，提高了mRNA的序列完整性。提高了mRNA的序列完整性。提高了mRNA的序列完整性。

【技术实现步骤摘要】
mRNA的制备方法


[0001]本专利技术涉及mRNA分子
，特别是涉及mRNA的制备方法。

技术介绍

[0002]随着核酸技术的发展，基因治疗越来越成为医药行业的热点，作为一种重要的基因疗法，核酸药物越来越受到市场的青睐。近年来，核酸药物已成为全球研发和投资的重点领域。相较于在蛋白层面进行疾病干预的传统药物，核酸药物能被递送到细胞内产生各种蛋白，包括可溶性蛋白、膜蛋白和细胞内蛋白，尤其是可以产生传统制药方法获得的蛋白，与DNA基因治疗相比，mRNA是一种瞬时表达工具，具有更好的生物安全性和成药性。mRNA药物在遗传信息传递源头发挥作用，因此具有特异性强、基因靶点丰富、疗效持久等优势，且避免传统药物复杂的合成与纯化流程，并能显著降低生产成本。随着mRNA的生产技术的发展和完善，人们已经可以在体外大量合成mRNA药物分子，并已应用于上市的mRNA新冠疫苗的生产，这给基于mRNA的基因药物带来了巨大的机遇。
[0003]目前常见的mRNA的合成方法为体外逆转录法，体外合成RNA(IVT)主要是以DNA为模板通过体外转录得到，常用的是以线性化质粒DNA或PCR扩增产物为模板利用RNA聚合酶在体外转录合成。主要过程是利用含有T7启动子(TAATACGACTCACTATAGGG)或SP6启动子(ATTTAGGTGACACTATAG)序列的DNA为模板在含有T7或SP6 RNA聚合酶的条件下，以NTP为底物合成与模板DNA中一条链互补的mRNA，简单快速获得大量的mRNA分子，通过在5
’
端加上帽子结构和3
’
端加ployA尾加强mRNA的稳定性。
[0004]现有的IVT转录工艺，通过序列合成和构建环状质粒，用限制性内切酶将环状质粒酶切成线性化质粒模板，将线性化质粒纯化后，进行IVT转录反应，转录过程是启动子和RNA聚合酶的随机的不停歇的启动和转录过程，最后的反应阶段存在大量未转录完成的mRNA序列片段，在加入DNaseⅠ消化模板终止反应的时候，大量未转录完成的mRNA序列片段被同时终止，使转录生产的mRNA中存在各种不同长度的mRNA序列片段，这些未转录完成的mRNA序列片段属于杂质，根据mRNA序列片段的特性，有形成dsRNA或被目标mRNA裹挟形成聚体的可能性。随着科研和市场的发展，传统的合成方法已经逐渐不能满足科研试验和药物研发对mRNA的需求，越来越多的mRNA生物研究和药物研发中对RNA产品的完整性也提出了更高的要求。

技术实现思路

[0005]基于此，有必要提供一种提高mRNA的完整性的mRNA的制备方法。
[0006]本申请的一个方面，提供了一种mRNA的制备方法。包括如下制备步骤：
[0007]提供线性DNA转录模板；所述线性DNA转录模板包括正义链和反义链；所述正义链包括启动子和目的DNA，所述启动子与所述目的DNA之间设有限制性酶切位点；
[0008]所述线性DNA转录模板于体外转录体系中进行第一阶段转录，制备第一阶段转录产物；
[0009]向所述第一阶段转录产物中加入识别所述限制性内切酶位点的限制性内切酶X，进行第二阶段转录，制备所述mRNA。
[0010]在其中一些实施例中，所述限制性内切酶X选自为SpeⅠ、EcoRⅠ和HindⅢ中的一种。
[0011]在其中一些实施例中，第二阶段转录的时间为15min～120min。
[0012]在其中一些实施例中，所述体外转录体系包括IVT转录体系。
[0013]在其中一些实施例中，第一阶段转录的时间为15min～120min。
[0014]在其中一些实施例中，所述启动子选自T7启动子、T3启动子和SP6启动子的一种。
[0015]在其中一些实施例中，所述目的DNA选自功能性基因、基因杂合体、基因变体和杂合体的一种或几种。
[0016]在其中一些实施例中，所述线性DNA转录模板的制备步骤包括：
[0017]构建环状质粒DNA；
[0018]采用限制性内切酶Y酶切所述环状质粒DNA，制备所述线性DNA转录模板；
[0019]所述限制性内切酶Y与所述限制性内切酶X识别的酶切位点不同；可选地，所述限制性内切酶Y选自BspQⅠ、EcoRⅠ和HindⅢ中的一种。
[0020]在其中一些实施例中，所述线性DNA转录模板的制备步骤还包括对获得的所述线性DNA转录模板进行纯化处理。
[0021]在其中一些实施例中，所述制备方法还包括：对第二阶段转录完成后，向所得产物中加入DNaseⅠ酶，酶切消化所述线性DNA转录模板，并对所得酶切消化产物进行纯化处理。
[0022]与传统方案相比，本申请具有以下有益效果：
[0023]本申请通过在DNA转录模板的启动子和目的基因之间设计唯一的限制性酶切位点，于体外转录体系中进行第一阶段转录反应，转录过程无明显产量上升后，加入对应的限制性内切酶后进行第二阶段转录反应，(切断所述线性DNA转录模板的启动子片段，使RNA聚合酶无法识别线性DNA转录模板，因此RNA聚合酶无法与线性DNA转录模板结合，即不再启动新的转录)，大部分的未转录完成的mRNA序列片段继续延伸完成转录，可转录成完整的mRNA，提高了mRNA的序列完整性。
附图说明
[0024]为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施方式。
[0025]图1为传统的体外转录mRNA(A)和本专利技术的体外转录mRNA(B)的制备过程示意图；
[0026]图2为采用本专利技术制备的mRNA的凝胶电泳图；条带2为实施例1，条带3为实施例2，条带1为对比例1，条带4为对比例2。
具体实施方式
[0027]为了便于理解本专利技术，下面将参照相关附图对本专利技术进行更全面的描述。附图中给出了本专利技术的较佳实施例。但是，本专利技术可以用不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本专利技术的公开内容的理解更加透彻全面。
[0028]除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本专利技术的
的
技术人员通常理解的含义相同。本文中在本专利技术的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本专利技术。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
[0029]术语
[0030]除非另外说明或存在矛盾之处，本文中使用的术语或短语具有以下含义：
[0031]本专利技术中，涉及“和/或”、“或/和”、“及/或”的选择范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。需要说明的是，当用至少两个选自“和/或”、“或/和”、“及/或”的连本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种mRNA的制备方法，其特征在于，包括如下制备步骤：提供线性DNA转录模板；所述线性DNA转录模板包括正义链和反义链；所述正义链包括启动子和目的DNA，所述启动子与所述目的DNA之间设有限制性酶切位点；所述线性DNA转录模板于体外转录体系中进行第一阶段转录，制备第一阶段转录产物；向所述第一阶段转录产物中加入识别所述限制性内切酶位点的限制性内切酶X，进行第二阶段转录，制备所述mRNA。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述限制性内切酶X选自为SpeⅠ、EcoRⅠ和HindⅢ中的一种。3.根据权利要求1所述的mRNA的制备方法，其特征在于，第二阶段转录的时间为15min～120min。4.根据权利要求1至3任一项所述的mRNA的制备方法，其特征在于，所述体外转录体系包括IVT转录体系。5.根据权利要求1至3任一项所述的mRNA的制备方法，其特征在于，第一阶段转录的时间为15min～120min。6.根据权利要求1至3任一项所述的mRNA的制备方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：张海峰，陈慧，刘欣，宋恒远，马宏丹，张劲松，代亚东，张胜，
申请(专利权)人：苏州博腾生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：