通过疏水相互作用色谱法改善DNA质粒制剂中RNA和污染物的去除制造技术

公开了一种用于从包含pDNA和污染物的样品制备纯化的pDNA制剂的方法，所述方法包括以下步骤：将样品与疏水相互作用色谱(HIC)材料在溶液中接触，所述溶液包含浓度能够迫使pDNA和污染物吸附在HIC材料上的共液性盐，在将pDNA吸附在HIC材料上之后，在中性盐存在下稀释共液性盐的浓度，从而将pDNA从HIC材料上解吸，而污染物通过中性盐的持续存在而保持吸附，并且获得pDNA制剂。此外，公开了一种用于制备待经受本发明专利技术的方法或其它纯化方法的样品的方法，特别是通过在HIC材料的存在下将样品暴露于中性盐的阴离子交换色谱法。暴露于中性盐的阴离子交换色谱法。暴露于中性盐的阴离子交换色谱法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】通过疏水相互作用色谱法改善DNA质粒制剂中RNA和污染物的去除
[0001]本专利技术涉及一种从包含pDNA和污染物的样品中制备纯化的pDNA制剂的方法。
[0002]背景
[0003]通过裂解生产细胞获得的DNA质粒普遍被蛋白质、RNA、RNA
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蛋白质聚集体和DNA
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蛋白质
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RNA聚集体污染。疏水相互作用色谱(HIC)是已知的质粒DNA(pDNA)纯化方法的手段之一[1]。将样品加入到含有高浓度沉淀盐的溶液中，并施加到HIC色谱柱上。pDNA会与色谱柱结合，但污染物也会与色谱柱结合。用下降的盐梯度洗脱色谱柱。在质粒异构体之间可以获得良好的分离，如超螺旋(sc)、开环(oc)和线性pDNA，但RNA在很大程度上与所需的scDNA共洗脱。还可以实现pDNA与宿主细胞蛋白、RNA
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蛋白质聚集体和DNA
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蛋白质
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RNA聚集体的良好分离。但HIC无法完全去除残留的污染物，这通常通过将HIC与阴离子交换色谱(AEC)组合来弥补。
[0004]专利技术概述
[0005]令人惊讶的是，已经发现，在中性盐(第二盐)的存在下，在洗脱色谱柱时通过降低共液性盐(kosmotropic salt)(第一盐)的浓度可以增强HIC对pDNA制剂中污染物的去除。在中性盐持续存在的情况下，通过降低共液性盐的浓度来回收pDNA。在第二盐的持续存在下，RNA，蛋白质，RNA
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蛋白质聚集体和DNA
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蛋白质
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RNA聚集体仍与色谱柱结合。据认为，中性盐迫使污染物与疏水柱保持紧密结合。这与传统的洗脱方法形成鲜明对比，传统的洗脱方法是在中性盐不存在的情况下，通过降低共液性盐的浓度而形成简单梯度，其中各种污染物与pDNA共同洗脱。这种方法减少了pDNA组分中污染物的量，并改变了pDNA组分中残留的污染物的光谱，因此，相比于HIC通常与另一种色谱法结合的方式，将本申请的方法与另一种色谱法结合能够产生纯度更高的pDNA。
[0006]本专利技术的主题是一种用于从包含pDNA和污染物的样品制备纯化的pDNA制剂的方法，所述方法包括以下步骤：
[0007]将样品与疏水相互作用色谱(HIC)材料在溶液中接触，所述溶液包含浓度能够迫使pDNA和污染物吸附在HIC材料上的共液性盐，
[0008]在将pDNA吸附在HIC材料上之后，在中性盐存在下稀释共液性盐的浓度，从而将pDNA从HIC材料上解吸，而污染物通过中性盐的持续存在而保持吸附，以及获得pDNA制剂。
[0009]术语“沉淀盐”代表蛋白质化学领域的延续概念，已知某些盐可有效沉淀蛋白质。硫酸铵就是一个例子。其他种类，如盐酸胍是强溶解剂，可防止沉淀。一些盐类(例如氯化钠)促进蛋白质沉淀的能力大大降低。已知各种盐对蛋白质溶解度效果与其各自在Hofmeister系列[2]中的排名有关。
[0010]促进沉淀的盐通常被归类为共液性盐类或感胶离子盐类。促进溶解度的盐通常被归类为离液盐。具有中间特性的盐(例如氯化钠)通常被归类为中性盐。
[0011]在本文中，术语“中性盐”应理解为不是指盐溶解在其中的水溶液的pH值。相反，术语中性盐被理解为任何盐，其中阳离子和阴离子的组合和平均贡献产生的效果既不是离液性的也不是共液性的，换句话说是中性的。通常，一价金属卤化物盐和一价金属醋酸盐被认
为是中性盐。
[0012]在本专利技术方法的一个实施方式中，所述共液性盐可以是含有共液性阴离子、阳离子或两者的盐，特别是选自下组的盐：硫酸铵、硫酸钠、磷酸钾、柠檬酸钠、柠檬酸钾，及其组合。典型地，所述的共液性盐的浓度可以在1.0M至2.5M，或1.25M至2.25M，或1.5M至2.0，或1.7M至1.9M的范围内。由于它们在水中的溶解度低，因此许多共液性盐的使用受到限制。磷酸钠就是一个例子。它在大约0.8M处饱和，这对于它来说太低因而不能用于本专利技术的方法或任何基于沉淀的技术。磷酸钾具有实用性，因为它在更高的浓度下仍可溶解。
[0013]在本专利技术方法的另一个实施方案中，所述的中性盐可以选自下组：氯化钠、氯化钾、氯化锂、氯化铵、乙酸钠、乙酸钾、乙酸锂、乙酸铵，及其组合。通常，所述的中性盐的浓度可以在0.5M至5.0M，或0.75M至4.0M，或1.0M至3.0M，或1.25M至2.5M，或l.5M至2.0M的范围内。
[0014]在本专利技术方法的另一个实施方案中，样品可以是含有质粒DNA的原核细胞的裂解物。
[0015]在本专利技术方法的另一个实施方案中，所述污染物可以选自下组：蛋白质、RNA、RNA
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蛋白质聚集体、DNA
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蛋白质聚集体和DNA
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蛋白质
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RNA聚集体。
[0016]在本专利技术方法的另一个实施方案中，所述的HIC材料可以是带有疏水配体的聚合物。
[0017]在本专利技术的方法的另一实施方案中，所述的疏水性配体可以具有芳族性质，例如苯基和/或苄基配体；或具有烷基性质，例如丁基、己基和/或辛基配体或其组合。
[0018]在本专利技术方法的另一个实施方案中，所述的HIC材料可以布置在色谱柱中。
[0019]在一个实施方案中，本专利技术的方法是用于从pDNA中去除污染物的单一方法。本专利技术的另一个实施方案是用于制备待经受其它纯化方法，特别是阴离子交换色谱法的样品的预纯化方法。特别地，如果采用预纯化方法，则所述的中性盐可以是氯化锂或氯化钙。在另一个实施方案中，本专利技术的方法是用于提高用其他方法(特别是阴离子交换色谱法)制备的pDNA的纯度的后纯化方法。
[0020]在本专利技术的预纯化方法的一个实施方案中，所述的HIC材料可以是疏水深度过滤材料，或者填充有多孔疏水颗粒或纳米纤维的柱。
[0021]在本专利技术的预纯化方法的另一个实施方案中，可向样品中加入共液性盐。在一个密切相关的变体中，所述的共液性盐可以作为液体浓缩物添加。在一个这样的实施方案中，所述添加可以通过混合装置进行调节，以快速获得均匀的混合物。在一个这样的实施方案中，所述混合可以在所述混合物与HIC柱接触之前立即进行，以使在所述样品接触所述柱之前形成沉淀物最小化。
[0022]在本专利技术的预纯化方法的另一个实施方案中，可以用水或低电导率缓冲液稀释样品，以制备用于阴离子交换色谱的样品。
[0023]在本专利技术的后纯化方法的一个实施方案中，可以将从阴离子交换剂洗脱出来并且仍然含有用于从阴离子交换剂中洗脱出来的中性盐的pDNA与共液性盐组合，以调节pDNA与HIC柱的结合。一般而言，与本专利技术的预纯化方法相比，该方法不那么复杂并且整体工艺流程更顺畅。
[0024]附图简要说明
[0025]图1描述了本专利技术方法的各阶段。
[0026]图2描述了DNA在共液性盐梯度中的洗脱。
[0027]图3描述了在中性盐的浓度保持恒定的情况下，质粒DNA在共液性盐梯本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于从包含pDNA和污染物的样品制备纯化的pDNA制剂的方法，所述方法包括以下步骤:将样品与疏水相互作用色谱(HIC)材料在溶液中接触，所述溶液包含共液性盐和中性盐，其浓度能够迫使pDNA和污染物吸附在HIC材料上，在将pDNA吸附在HIC材料上之后，在中性盐存在下降低共液性盐的浓度，从而将pDNA从HIC材料上解吸，而污染物通过中性盐的持续存在而保持吸附，并且获得pDNA制剂。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述共液性盐选自下组：硫酸铵、硫酸钠、磷酸二氢钾、柠檬酸钠、柠檬酸钾，或其组合。3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述共液性盐的浓度为1.0M至2.5M、或1.25M至2.25M、或1.5M至2.0、或1.7M至1.9M。4.如权利要求1
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3中任一项所述的方法，其特征在于，所述中性盐选自下组：氯化钠、氯化钾、氯化锂、氯化铵、乙酸钠、乙酸钾、乙酸锂、乙酸铵，或其组合。5.如权利要求1
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4中任一项所述的方法，其特征在于，所述中性盐的浓度在0.5M至5.0M、或0.75M至4.0M、或1.0M至3.0M、或1.25M至2.5M、或1.5M至2.0M的范围内。6.如权利要求1
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【专利技术属性】
技术研发人员：P，
申请(专利权)人：赛多利斯比亚分离有限责任公司，
类型：发明
国别省市：