一种用于检测病原微生物的核酸提取试剂盒及其提取方法技术

本发明专利技术公开了一种用于检测病原微生物的核酸提取试剂盒及其提取方法。试剂盒中包括：裂解液、结合液、漂洗液Ⅰ、漂洗液Ⅱ、洗脱液、终止液、磁珠、裂解珠、复合酶。本发明专利技术采用机械法联合酶解法，并优化研磨和孵育条件，在提高革兰氏阳性菌和真菌的DNA得率的同时缩短裂解时间，并且减少核酸断裂及后续建库造成的片段丢失。采用磁珠法提取相较于柱提法减少核酸在硅胶柱纯化过程中造成的丢失，同时利于实现提取自动化和标准化。自动化和标准化。

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测病原微生物的核酸提取试剂盒及其提取方法


[0001]本专利技术属于核酸提取
，具体涉及一种用于检测病原微生物的核酸提取试剂盒及其提取方法。

技术介绍

[0002]感染人类的病原微生物包括细菌、真菌、病毒、原虫、支原体和衣原体等，宏基因组测序为检测这些微生物组成提供了一种不需要分离培养的新方法。该方法可以实现对病原微生物组的高通量、大规模快速检测。然而来源于临床的病原样本，如肺泡灌洗液、脑脊液、腹水等，往往微生物浓度低，其中某些致病微生物的含量更是微乎其微。此外，微生物中的真菌和革兰氏阳性菌结构坚硬难以裂解。为有效分析临床样本的致病微生物群，DNA的提取方法尤为重要，直接关系到宏基因组测序和分类鉴定的质量。
[0003]目前在微生物核酸提取和纯化中，机械裂解法，如珠打被认为是裂解的金标椎。由于打珠能有效地裂解多种微生物，因此该方法一直被广泛用于革兰氏阳性和阴性菌的裂解。然而，珠打后获得的DNA大部分被剪切到非常小的片段，经片段筛选后获得的DNA产量十分有限，往往会丢失某些致病微生物的特异性片段。另外珠打法对于更易裂解的微生物，DNA片段更短、更容易剪切的DNA有偏向性。酶解法则以最小的剪切作用，在对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的裂解效率上显示相对一致，但是需要较长的裂解处理时间。上述方法主要针对细菌的裂解，真菌的核酸得率很低。因此，从临床样本中提取足够数量的DNA，提高革兰氏阳性菌和真菌的DNA得率，均匀反映样本的微生物组成一直是个亟待解决的问题。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种可以提高革兰氏阳性菌和真菌的DNA得率的试剂盒。
[0005]本专利技术所采取的技术方案是：
[0006]本专利技术的第一方面，提供一种用于病原微生物核酸提取的试剂盒，包括：裂解液、结合液、漂洗液Ⅰ、漂洗液Ⅱ、洗脱液、终止液、磁珠、裂解珠、复合酶；所述复合酶包：溶壁酶、壳多糖酶、溶葡球菌酶、溶菌酶；其中溶壁酶、壳多糖酶、溶葡球菌酶、溶菌酶之间的酶活力比值为：(5
‑
10)：(10
‑
30)：(25
‑
35)：(25
‑
35)。
[0007]在本专利技术的一些实施方式中，所述溶壁酶为5
‑
10U/mL、壳多糖酶为10
‑
30U/mL、溶葡球菌酶为25
‑
35U/mL、溶菌酶为25
‑
35U/mL。
[0008]裂解液可以使蛋白质变性，抑制核酸酶对DNA的降解，并沉淀蛋白，同时为释放的DNA提供一个缓冲体系，使DNA更加稳定。结合液可使蛋白质变性，导致细胞结构破碎，同时抑制核酸酶活性。漂洗液Ⅰ、漂洗液Ⅱ主要是漂洗DNA，去除残余的盐类。洗脱液溶解DNA，并提供一个稳定保存DNA的环境。终止液可使蛋白变性，终止酶促反应。磁珠主要是通过磁珠表面的基团富集核酸。裂解珠通过机械作用用于破碎难以裂解的细胞壁，提高裂解效率。复合酶主要是协同裂解，降低过度机械破碎导致的核酸断裂。
[0009]在本专利技术的一些实施方式中，所述裂解液包含：Tris
‑
HCl 0.2
‑
0.5M，EDTA 40
‑
50mM、NaCl 0.2
‑
0.3M、ProClin300 0.01
‑
0.05％。
[0010]在本专利技术的一些实施方式中，所述结合液包含：盐酸胍3
‑
5M、Triton X
‑
100 5
‑
10％、吐温5
‑
10％。
[0011]在本专利技术的一些实施方式中，所述吐温可以为吐温20、吐温40、吐温60、吐温80。
[0012]在本专利技术的一些实施方式中，所述漂洗液I包含：盐酸胍3
‑
5M，乙醇50
‑
60％。
[0013]在本专利技术的一些实施方式中，所述漂洗液II包含：Tris
‑
HCl 20
‑
30mM、乙醇70
‑
80％。
[0014]在本专利技术的一些实施方式中，所述洗脱液包含：Tris 10
‑
20mM、EDTA 0.2
‑
0.4mM、ProClin300 0.01
‑
0.05％。
[0015]在本专利技术的一些实施方式中，所述终止液包含：蛋白酶K 10
‑
20mg/mL、SDS 0.1
‑
0.2％。
[0016]在本专利技术的一些实施方式中，所述磁珠为羟基磁珠。
[0017]在本专利技术的一些实施方式中，所述裂解珠包含石榴石、氧化锆珠、二氧化硅珠、玻璃珠中的至少一种。
[0018]在本专利技术的一些实施方式中，所述氧化锆珠的粒径为0.5～1.5mm。
[0019]本专利技术的第二方面，提供本专利技术第一方面所述的试剂盒在提取核酸中的应用。
[0020]在本专利技术的一些实施方式中，所述核酸为DNA或RNA。
[0021]在本专利技术的一些实施方式中，所述核酸为病原微生物的核酸。
[0022]在本专利技术的一些实施方式中，所述病原微生物包含：细菌、真菌、病毒、原虫、支原体、衣原体。
[0023]本专利技术的第三方面，提供一种提取核酸的方法，所述提取方法包含以下步骤：
[0024]S1：向样本中加入裂解液和裂解珠，研磨，加溶菌酶进行反应，然后加入蛋白酶抑制剂终止酶促反应；
[0025]S2：取上清加入核酸结合液，用磁珠富集、洗脱液洗脱磁珠，获得核酸。
[0026]在本专利技术的一些实施方式中，磁珠富集后进一步漂洗，具体步骤为：分别使用漂洗液I和漂洗液II进行第一次漂洗和第二次漂洗。
[0027]在本专利技术的一些实施方式中，所述研磨条件为59
‑
65Hz研磨10
‑
15min或常温2000
‑
3000rpm震荡10
‑
15min；时间过长会造成核酸断裂。
[0028]在本专利技术的一些实施方式中，所述溶菌酶的反应条件为：36
‑
38℃、10～15min。
[0029]在本专利技术的一些实施方式中，所述样本包含：肺泡灌洗液、脑脊液、脓液、腹水、痰液、血液、阴道分泌物、粪便、组织、细胞。
[0030]本专利技术的有益效果是：
[0031]本专利技术提供一种用于病原微生物核酸提取的试剂盒，包括：裂解液、结合液、漂洗液Ⅰ、漂洗液Ⅱ、洗脱液、终止液、磁珠、裂解珠、复合酶；所述复合酶包：5
‑
10U/mL溶壁酶、10
‑
30U/mL壳多糖酶、25
‑
35U/mL溶葡球菌酶、25
‑
35U/mL溶菌酶。在提高革兰氏阳性菌和真菌的DNA得率的同时缩短裂解时间，并且减少核酸断裂及后续建库造成的片段丢本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于病原微生物核酸提取的试剂盒，包括：裂解液、结合液、漂洗液、洗脱液、终止液、磁珠、裂解珠、复合酶；所述复合酶包含：溶壁酶、壳多糖酶、溶葡球菌酶、溶菌酶；其中溶壁酶、壳多糖酶、溶葡球菌酶、溶菌酶之间的酶活力比值为：(5
‑
10)：(10
‑
30)：(25
‑
35)：(25
‑
35)。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述裂解液包含：Tris
‑
HCl 0.2
‑
0.5M，EDTA 40
‑
50mM、EDTA
‑
2Na 40
‑
50mM、NaCl 0.2
‑
0.3M、KCl 0.15
‑
0.2M、ProClin300 0.01
‑
0.05％；优选地，所述结合液包含：盐酸胍3
‑
5M、Triton X
‑
100 5
‑
10％、吐温5
‑
10％。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述漂洗液包含漂洗液I和漂洗液II，所述漂洗液I包含：盐酸胍3
‑
5M，乙醇50
‑
60％、异丙醇40
‑
50％；优选地，所述漂洗液II包含：Tris
‑
HCl 20
‑
30mM、乙醇70

【专利技术属性】
技术研发人员：雷春燕，尹晗琪，孙诗园，
申请(专利权)人：广州盘古医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：