体外转录缓冲液、转录反应体系、制备方法及应用技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，尤其是涉及一种体外转录缓冲液、转录反应体系、制备方法及应用；一种体外转录缓冲液，包括如下浓度的组分：HEPES 100

【技术实现步骤摘要】
体外转录缓冲液、转录反应体系、制备方法及应用


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其是涉及一种体外转录缓冲液、转录反应体系、制备方法及应用。

技术介绍

[0002]自2019年开始，SARS
‑
CoV
‑
2(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2)在全球肆虐，对人类的生理、心理，甚至社会都造成了不容忽视的恶劣影响。2020年，Moderna和BioNTech以史无前例的速度完成了两款新冠疫苗的研发与上市，紧接着，国内也先后出现多家上市的新冠疫苗，例如智飞、康希诺等，目前国内新冠疫苗增至十余款，多家企业积极布局研发。随着新冠疫苗的成功，mRNA疫苗行业迅速发展，针对其他传染病以及肿瘤治疗的新型mRNA疫苗如雨后春笋般涌现。
[0003]作为一种携带遗传信息、可直接决定蛋白翻译的物质，mRNA在1961年被首次发现后便一直备受科学家的关注。20世纪90年代，科学家们开展了一系列关于mRNA体外转录(in vitro transcription，IVT)的临床前研究，以进一步探索其在疾病治疗领域的应用。但由于当时科学技术水平的限制，有关mRNA稳定性及递送方面的问题一直没有获得突破。为紧急应对新冠疫情，近两年mRNA IVT技术的发展速度几乎空前绝后。
[0004]目前，体外转录大都以线性化质粒为模板，即mRNA IVT前需通过内切酶使环状质粒转变为线性化质粒，酶切后的产物须经过纯化后才可用于后续的IVT过程。现有技术中通过使用一个反应体系，但分步添加限制性内切酶和T7 RNA Polymerase的形式，实现线性化和体外转录的连续反应。
[0005]IVT需以线性化质粒为模板，现阶段常规方法是在IVT前单独对环状质粒进行酶切，经纯化回收后方可用于后续IVT，步骤繁琐，并且势必会造成一部分模板的损耗，增加工艺流程和成本。线性化和体外转录两步反应在同一体系同一时间内进行的难点在于：两步反应所使用的酶在同一反应体系内均保持较高的生物学活性，且不互相干扰。因此，对反应体系的成分比例要求较高。
[0006]因此，如何实现线性化和体外转录两步反应在同一体系同一时间内进行，成为众多厂家索要解决的问题。

技术实现思路

[0007]针对现有技术的不足，本申请提供一种mRNA体外转录试剂盒及转录方法。
[0008]第一方面，本申请提供一种体外转录缓冲液，采用如下的技术方案：一种体外转录缓冲液，包括如下浓度的组分：
[0009]优选的，一种体外转录缓冲液，包括如下浓度的组分：
[0010]上述体外转录缓冲液的pH为7.5
‑
8.5。
[0011]本申请中公开了一种体外转录缓冲液，在含有HEPES、醋酸镁、亚精胺、二硫苏糖醇、PEG8000的缓冲体系下，线性化和体外转录两步反应可实现同时进行。
[0012]HEPES即4
‑
羟乙基哌嗪乙磺酸，是一种氢离子缓冲剂，能较长时间控制恒定的pH范围；它的分解能力可随着温度的升高而增强，随着温度的降低而减弱，与其他缓冲剂相比，低温时它可较好的保持酶的结构和功能。
[0013]亚精胺是一种多胺，虽然目前研究来看亚精胺对转录的作用机制不是很明确。但从应用层面，在亚精胺浓度比较低的时候对DNA与蛋白的结合有促进作用，这会让酶更易识别和结合DNA模板从而使转录更加容易进行提高转录效果。
[0014]DTT即二硫苏糖醇，是一种小分子有机还原剂，其还原性很大程度上是由于其氧化状态六元环(含二硫键)的构象稳定性；DTT的用途之一是作为巯基化DNA的还原剂和去保护剂，巯基化DNA末端硫原子在溶液中趋向于形成二聚体，特别是在存在氧气的情况下；这种二聚化大大降低了一些体外反应实验的效率；而在DNA溶液中加入DTT，可以降低DNA的二聚化。DTT的还原力受pH值的影响，只在pH值大于7的情况下能够发挥还原作用。这是因为只有脱去质子的硫醇盐负离子才具有反应活性，硫醇则没有；而巯基的pKa一般为8.3。
[0015]PEG8000是分子量7500
‑
8500的聚乙二醇，生物大分子在高浓度条件下在轻微的pH等条件变化下容易产生聚体。随着体外转录的进行，作为副产物的焦磷酸不断产生，有降低反应体系pH的趋势。虽然缓冲液中pH缓冲对成分的存在在一定程度上减缓了pH降低的程度和过程，但无法根本上杜绝反应体系pH在一定程度内的降低。因此，PEG8000的存在可以更均匀地分散产物mRNA，减少转录过程中聚体的产生，提高转录产物质量。
[0016]第二方面，本申请提供一种转录反应体系，采用如下的技术方案：一种转录反应体系，包括上述的转录缓冲液。
[0017]优选的，转录反应体系还包括如下浓度的组分：内切酶
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
0.1
‑
1μL；T7聚合酶
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
0.5
‑
2μL。
[0018]优选的，转录反应体系还包括如下浓度的组分：
[0019]优选的，转录反应体系还包括如下浓度的组分：质粒1
‑
10μg。
[0020]在一个具体的可实施方案中，一种转录反应体系，包括如下浓度的组分：
[0021]在一个具体的可实施方案中，一种转录反应体系，包括如下浓度的组分：在一个具体的可实施方案中，一种转录反应体系，包括如下浓度的组分：
[0022]优选的，内切酶包括但不限于Xba I、Xho I、Spe I或Bsa I。
[0023]优选的，CAP包括但不限于CAP GAG。
[0024]优选的，UTP包括N1
‑
Me
‑
pUTP或UTP或UTP衍生物。
[0025]优选的，ATP包括ATP或ATP衍生物。
[0026]优选的，GTP包括GTP或GTP衍生物。
[0027]优选的，CTP包括CTP或CTP衍生物。
[0028]在一个具体的可实施方案中，转录反应体系包括如下组分：在一个具体的可实施方案中，转录反应体系包括如下组分：第三方面，本申请提供一种mRNA体外转录方法，采用如下的技术方案：一种mRNA体外转录方法，步骤如下：以环状质粒为起始模板，加入转录缓冲液、ATP、GTP、CTP、UTP、CAP、内切酶、T7聚合酶，混合，进行mRNA体外转录。
[0029]优选的，混合的温度为36
‑
38℃，反应时间为1
‑
5小时。
[0030]优选的，所述mRNA体外转录方法还包括将得到混合液去除DNA模板残留的步骤。
[0031]在一个具体的可实施方案中，一种mRNA体外转录方法，步骤如下：(1)以环状质粒为起始模板，加入10
×
Reaction buffer、NTPs(ATP、GTP、CTP、N1
‑
Me
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种体外转录缓冲液，其特征在于，包括如下浓度的组分：HEPES
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
100
‑
500mM；醋酸镁
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
50
‑
600mM；亚精胺
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ5‑
40mM；二硫苏糖醇
ꢀꢀꢀꢀꢀ
50
‑
200mM；PEG8000
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
质量浓度为0.1
‑
1.0%。2.根据权利要求1所述的一种体外转录缓冲液，其特征在于，包括如下浓度的组分：HEPES
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
100
‑
500mM；醋酸镁
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
100
‑
600mM；亚精胺
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ5‑
35mM；二硫苏糖醇
ꢀꢀꢀꢀ
60
‑
150mM；PEG8000
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
质量浓度为0.1
‑
1.0%。3.一种转录反应体系，其特征在于：包括权利要求1或2所述的转录缓冲液。4.根据权利要求3所述的一种转录反应体系，其特征在于，转录反应体系还包括如下浓度的组分：内切酶
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
0.1
‑
1μL；T7聚合酶
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
0.5
‑
...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖潇，尹丹丹，华成品，
申请(专利权)人：江苏申基生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：