一种化学药物nCoVshRNA制造技术

本发明专利技术涉及一种靶向药物nCoVshRNA

【技术实现步骤摘要】
一种化学药物nCoVshRNA
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2RBD的合成方法


[0001]本专利技术涉及一种化学药物nCoVshRNA
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2RBD的合成方法，属于生物制药领域。

技术介绍

[0002]新型冠状病毒的主要结构包括单股正链核酸(ssRNA)、刺突蛋白(S)、膜蛋白(M)、包膜蛋白(E)和核壳蛋白(N)，其中S蛋白的N端由结构域(S1
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NTD)和受体结合域(S1
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RBD)组成，新型冠状病毒通过其受体结合域S1
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RBD与宿主细胞受体ACE2结合引起感染。
[0003]ACE2为I型跨膜糖蛋白，由805个氨基酸组成，包括跨膜区、胞内羧基端和胞外氨基端，冠状病毒通过其S1
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RBD与ACE2的细胞外催化结构域互动结合，导致细胞内吞、膜融合，使病毒进入表达ACE2或含有ACE2受体的细胞。
[0004]因新冠病毒通过其RBD与ACE2结合引起感染，所以现有疫苗基本针对RBD进行研发，已有多款疫苗用于临床，世界各国也尝试了如瑞德西韦、洛西那韦、利托那韦、氯喹、羟氯喹、激素、干扰素等药物，虽然取得了某些效果，但特别是针对变异毒株目前仍缺少特效药。
[0005]RNA干扰(RNAi)作为一种高效的序列特异性基因沉默技术，正在给疾病的治疗带来难以想象的应用前景，已有多种siRNA药物被FDA审批上市。小干扰RNA(siRNA)大约21～23bp，以参与RNA干扰(RNAi)的方式调节基因表达,特异性降解与之互补的靶信使RNA(mRNA)，但无论是细胞水平还是活体内，使用siRNA进行基因干扰均要克服很多困难：1)膜通透性：siRNA带有大量的负电荷，分子量大(～13KD)，自身很难穿过细胞膜，运输siRNA主要靠化学修饰和一些运输载体；2)抗核酸酶降解：siRNA由大量的核糖核酸分子构成，很容易被外界的RNA酶降解，如果在设计siRNA及选择运输载体时不对碱基进行特定的化学修饰或采取载体保护方法，则在siRNA进入作用位点前即被RNA酶降解；3)靶向递送及载体：siRNA的作用位点主要在靶细胞浆内，所以需将siRNA特异性递送给靶细胞浆，如果不能有效地选用合适的靶向递送载体并及时使siRNA从内涵体释放到胞浆，通常可激活细胞免疫反应，导致干扰素等细胞因子的释放，所以，如何有效地将siRNA运输并释放到靶细胞浆是影响RNAi效果的瓶颈问题，有些siRNA能导致序列或浓度依赖性非特异性基因沉默即脱靶，因此，在设计siRNA时，应同时考虑靶向递送、基因抑制效果以及尽可能选择低脱靶效应的序列。
[0006]在COVID
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19的防治中，如果能以合适的靶向递送载体将nCoVsiRNA稳定地、特异地依次递送给靶器官、靶组织、靶细胞、定位于靶细胞、穿越靶细胞膜、释放到靶细胞浆，并对多种变异毒株广谱有效，就应能更好地开展COVID
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19的靶向基因治疗。
[0007]所以，本专利技术要合成一种以RBD靶向递送shRNA的化学药物nCoVshRNA
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2RBD。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的是要提供一种以RBD靶向递送shRNA的nCOVsiRNA药物及其合成和用途；在nCOVsiRNA药物中，shRNA具有靶向基因治疗和免疫佐剂的双重作用，RBD具有靶向递
送和蛋白疫苗的双重作用，脂质体具有稳定shRNA、细胞转染和免疫佐剂的作用。
[0009]本专利技术的目的通过以下技术方案实施：
[0010]筛选抗变异毒株靶标siRNA，合成shRNA，进而在shRNA双链末端分别延接RBD多肽，合成集新冠病毒靶向药物和新型疫苗为一体的化学药物nCoVshRNA
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2RBD。
[0011]抗变异毒株靶标的筛选：从各种致病性冠状病毒及其变异毒株的共有基因中筛选siRNA，这种共有基因包括保守基因、超保守基因和/或保守微卫星，使所筛选的siRNA为不随病毒变异而改变的各变异毒株的共同靶标，使之具有广谱抗变异毒株的作用。
[0012]合成抗变异毒株靶标siRNA：将筛选的siRNA合成2条互补的21
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25nt的寡核苷酸siRNA，并合成起间隔作用的碱基序列。
[0013]合成shRNA：将已合成的2条互补寡核苷酸多肽siRNA和起间隔作用的碱基序列进一步合成由中间碱基序列间隔成loop环的小发夹shRNA双链。
[0014]优选siRNA：将合成的shRNA构建干扰载体，检测其mRNA表达、蛋白表达和干扰效果，经siRNA设计、合成、筛选、迭代设计和验证，优选具有高沉默效率的siRNA。
[0015]合成优选的siRNA和shRNA：采用优选的siRNA序列按上述所述合成siRNA、shRNA，包括为增加稳定性和避免脱靶进行的化学修饰。
[0016]合成RBD多肽或蛋白：合成位于但不限于冠状病毒S蛋白的第319
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510位氨基酸序列、位于但不限于N439、V483和Q493位点的保守氨基酸序列及经密码子优化的氨基酸序列。
[0017]化学药物nCoVshRNA
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2RBD的合成：以二硫键、磷酸二酯键、二硫代磷酸脂键、硫醚键、肟键、酰胺键或马来酰亚胺
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巯基键等偶联方法将已合成的shRNA和RBD进行连接；或根据shRNA的核苷酸序列和RBD的氨基酸序列合成RBD
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shRNA
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RBD。
[0018]化合物的提纯：以高效液相色谱、反向高效液相色谱或离子交换色谱提纯化合物。
[0019]化合物的脂质体修饰：通过带负电荷的shRNA吸附带正电荷的脂质体制备脂质体修饰化合物；通过RBD氨基的巯基化使巯基与脂质体的马来酰胺形成马来酰亚胺
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巯基键制备PEG内化的脂质体修饰化合物；通过RBD氨基末端与脂质体形成氨甲酸酯键制备脂质体修饰化合物；通过RBD或RBD片段连接脂质体修饰的siRNA制备脂质体或脂质纳米粒修饰的化合物。
[0020]化合物的验证：在体外细胞水平检测化合物对2种或以上不同变异毒株的抗病毒效果，观察是否具有以保守基因为靶标的广谱抗变异毒株作用；检测化合物在动物体内是否具有靶向递送shRNA的RNAi作用、疫苗的免疫作用以及是否有免疫增强的效果。
[0021]本专利技术的有益效果在于：
[0022]首次发现源自冠状病毒受体结合域的新型靶向递送载体RBD和源自冠状病毒保守基因的广谱抗变异毒株靶标shRNA，并将RBD和shRNA合成为以RBD靶向递送shRNA的化学药物nCoVshRNA
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2RBD。其中shRNA起广谱抗变异毒株和免疫佐剂的作用，RBD起靶向递送shRNA、保护shRNA和蛋白疫苗的作用，并使RBD和shRNA相互增效，进一步产生诸多新功能。
[0023]本专利技术与传统siRNA药物的区别特本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种化学药物nCoVshRNA
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2RBD的合成方法，其特征在于，将具有RNAi功能的正、反义链siRNA合成shRNA，然后在合成的shRNA的正义链siRNA和/或反义链siRNA的未端延伸连接靶向递送载体，合成以shRNA双链连接载体进行shRNA靶向递送的siRNA药物。2.根据权利要求1所述的一种化学药物nCoVshRNA
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2RBD的合成方法，其特征在于，所述siRNA选自病原体及其变异毒株的共有RNAi序列，使以所述siRNA合成的shRNA靶向干扰含有所述共有RNAi序列的病毒基因，从而产生抗变异毒株的广谱RNAi作用。3.根据权利要求1、2所述的一种化学药物nCoVshRNA
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2RBD的合成方法，其特征在于，所述合成shRNA包括但不限于首先合成2条互补的约21
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25nt的siRNA，以及合成起间隔作用的碱基序列，然后将所合成的siRNA和碱基序列连接成由所述碱基序列间隔成中间为loop环的小发夹状shRNA，继之在shRNA的每条单链上各连接靶向递送载体。4.根据权利要求1、3所述的一种化学药物nCoVshRNA
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2RBD的合成方法，其特征在于，合成以冠状病毒受体结合域S1
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RBD为载体向ACE2表达细胞靶向递送冠状病毒变异毒株共有RNAi靶标shRNA的集广谱抗变异毒株靶向药物和二聚体S1
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RBD疫苗为一体的化合物；所述广谱抗变异毒株靶向药物，是指基于冠状病毒及其变异毒株的共有RNAi序列设计不随病毒变异而改变的具有广谱抗变异毒株作用的siRNA，然后将所述siRNA合成shRNA；将所述shRNA和既是穿胞肽又是ACE2配体的S1
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RBD多肽进行连接后，使shRNA的胞膜通透性和抗核酸酶稳定性得到优化，使shRNA更易被特异性递送至表达ACE2的靶细胞浆，特异性沉默易感染病毒的ACE2表达细胞内的靶基因；所述二聚体S1
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RBD疫苗，是指将既具有广谱抗变异毒株作用又具有免疫佐剂作用的1分子shRNA和具有蛋白质抗原作用的2分子S1
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RBD多肽进行连接，合成分子结构更复杂、分子量更大并含有自身免疫佐剂成分的新型技术线路疫苗。5.根据权利要求1、4所述的一种化学药物nCoVshRNA
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2RBD的合成方法，其特征在于，所述合成shRNA的siRNA包括但不限于新冠病毒RNAi序列SEQ ID NO.1～58；包括但不限于优选的新冠病毒共有RNAi序列SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7～10、SEQ ID NO.16～18、SEQ ID NO.20～22、SEQ ID NO.30～32、SEQ ID NO.41～58。6.根据权利要求1、5所述的一种化学药物nCoVshRNA
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2RBD的合成方法，其特征在于，所述合成shRNA的siRNA进一步优选为靶向冠状病毒N基因的SEQ ID NO.16
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18和SEQ ID NO.49
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51，靶向冠状病毒ORF1ab基因的SEQ ID NO.20
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22和SEQ ID NO.52
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54，以及靶向冠状病毒S基因的SEQ I...

【专利技术属性】
技术研发人员：翁炳焕，黄荷凤，贺林，王伟平，姚旭峰，朱智勇，马端，林佳丽，陈敏，严恺，
申请(专利权)人：杭州痴创生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：