一种以ACE2靶向递送shRNA的ACE2siRNA药物制备方法技术

一种以ACE2靶向递送shRNA的ACE2siRNA药物制备方法，从冠状病毒保守基因或微卫星中筛选靶标siRNA，由两条互补的正反义siRNA链合成带loop环的小发夹shRNA，并合成以受体结合域RBD为配体的ACE2或穿胞肽ACE2，然后将ACE2分别连接到shRNA的正反义链上，合成由shRNA区和ACE2区构成的ACE2siRNA，其中双价ACE2起中和RBD和靶向递送shRNA的作用，以ACE2桥接的“shRNA

【技术实现步骤摘要】
一种以ACE2靶向递送shRNA的ACE2siRNA药物制备方法


[0001]本专利技术涉及一种以ACE2靶向递送shRNA的ACE2siRNA药物制备方法，属于传染病防治的生物制药领域。

技术介绍

[0002]新型冠状病毒的主要结构包括单股正链核酸(ssRNA)、刺突蛋白(S)、膜蛋白(M)、包膜蛋白(E)和核壳蛋白(N)，其中S蛋白的N端由结构域(S1
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NTD)和受体结合域(S1
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RBD)组成，新型冠状病毒通过其受体结合域S1
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RBD与宿主细胞受体ACE2结合引起感染。
[0003]ACE2为I型跨膜糖蛋白，由805个氨基酸组成，包括跨膜区、胞内羧基端和胞外氨基端，冠状病毒通过其S1
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RBD与ACE2的细胞外催化结构域互动结合，导致细胞内吞、膜融合，使病毒进入表达ACE2或含有ACE2受体的细胞。
[0004]RNA干扰(RNAi)作为一种高效的序列特异性基因沉默技术，正在给疾病的治疗带来难以想象的应用前景，已有多种siRNA药物被FDA审批上市。小干扰RNA(siRNA)大约21～23bp，以参与RNA干扰(RNAi)的方式调节基因表达,特异性降解与之互补的靶信使RNA(mRNA)，但无论是细胞水平还是活体内，使用siRNA进行基因干扰均要克服很多困难：1)膜通透性：siRNA带有大量的负电荷，分子量大(～13KD)，自身很难穿过细胞膜，运输siRNA主要靠化学修饰和一些运输载体；2)抗核酸酶降解：siRNA由大量的核糖核酸分子构成，很容易被外界的RNA酶降解，如果在设计siRNA及选择运输载体时不对碱基进行特定的化学修饰或采取载体保护方法，则在siRNA进入作用位点前即被RNA酶降解；3)靶向递送及载体：siRNA的作用位点主要在靶细胞浆内，所以需将siRNA特异性递送给靶细胞浆，如果不能有效地选用合适的靶向递送载体并及时使siRNA从内涵体释放到胞浆，通常可激活细胞免疫反应，导致干扰素等细胞因子的释放，所以，如何有效地将siRNA运输并释放到靶细胞浆是影响RNAi效果的瓶颈问题，有些siRNA能导致序列或浓度依赖性非特异性基因沉默即脱靶，因此，在设计siRNA时，应同时考虑靶向递送、基因抑制效果以及尽可能选择低脱靶效应的序列。
[0005]在COVID
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19的防治中，如果能以合适的靶向递送载体将nCoVsiRNA稳定地、特异地依次递送给靶器官、靶组织、靶细胞、定位于靶细胞、穿越靶细胞膜、释放到靶细胞浆，并对多种变异毒株广谱有效，就应能更好地开展COVID
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19的靶向基因治疗。
[0006]所以本专利技术要设计和合成以ACE2中和RBD及靶向递送shRNA的广谱抗病毒ACE2siRNA。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的是要提供一种以ACE2靶向递送shRNA的ACE2siRNA药物及其合成方法和用途，使双价ACE2能与RBD结合而起中和病毒和靶向递送shRNA作用，并使被ACE2靶向递送的shRNA间接结合RBD而形成“shRNA
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ACE2
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RBD
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病毒”的复合物，进而使shRNA被复合物靶向递送，随着病毒的感染进入靶细胞，起广谱而靶向的抗变异毒株作用。
[0008]本专利技术的目的通过以下技术方案实施：
[0009]筛选共有基因：从数据库记载的各种致病性冠状病毒及其变异毒株中筛选不随病毒变异而改变的共有基因，包括保守基因、超保守基因和/或保守微卫星。
[0010]筛选siRNA：从共有基因中预选多对以该共有基因为干扰靶标的siRNA，使siRNA包含有保守基因、超保守基因和/或保守微卫星。
[0011]合成siRNA：合成2条互补的21
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25nt的寡核苷酸siRNA及起间隔作用的碱基序列。
[0012]合成shRNA：将已合成的2条互补寡核苷酸多肽siRNA和起间隔作用的碱基序列进一步合成由中间碱基序列间隔成loop环的小发夹shRNA双链。
[0013]优选siRNA：将合成的shRNA构建干扰载体，检测其mRNA表达、蛋白表达和干扰效果，经siRNA设计、合成、筛选、迭代设计和验证，优选具有高沉默效率的siRNA。
[0014]合成优选的siRNA和shRNA：采用优选的siRNA序列按上述合成siRNA、shRNA，包括为增加稳定性和避免脱靶进行的化学修饰。
[0015]合成ACE2多肽或蛋白：合成的ACE2包括但不限于全长ACE2、第741
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763位氨基酸的跨膜ACE2、第764
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805位氨基酸的胞内ACE2、第1
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740位氨基酸的胞外ACE2以及经氨基酸序列密码子优化的ACE2多肽或蛋白。
[0016]ACE2siRNA的合成：以二硫键、磷酸二酯键、二硫代磷酸脂键、硫醚键、肟键、酰胺键或马来酰亚胺
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巯基键等偶联方法将已合成的shRNA和ACE2连接、合成为化合物；或根据shRNA的核苷酸序列和ACE2的氨基酸序列从氨基酸水平直接合成ACE2
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shRNA
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ACE2。
[0017]ACE2siRNA的提纯：以高效液相色谱、反向高效液相色谱或离子交换色谱进行提纯。
[0018]ACE2siRNA的脂质体修饰：通过带负电荷的shRNA吸附带正电荷的脂质体制备脂质体修饰化合物；通过ACE2氨基的巯基化使巯基与脂质体的马来酰胺形成马来酰亚胺
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巯基键制备PEG内化的脂质体修饰化合物；通过ACE2氨基与脂质体形成氨甲酸酯键制备脂质体修饰化合物；通过ACE2或ACE2片段连接脂质体修饰的siRNA制备脂质体修饰化合物。
[0019]ACE2siRNA的验证：在体外细胞水平检测ACE2siRNA对2种或以上不同变异毒株的抗病毒效果，观察是否具有以保守基因为靶标的广谱抗变异毒株作用；检测ACE2siRNA在动物体内是否具有靶向递送shRNA的作用以及是否能刺激宿主产生ACE2
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Ab。
[0020]本专利技术的有益效果在于：
[0021]首次设计抗冠状病毒变异靶标siRNA/shRNA，首次以ACE2作为靶向递送载体，首次以shRNA和ACE2合成具有靶向递送、中和病毒和产生ACE2
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Ab作用的ACE2siRNA。
[0022]本专利技术基于保守基因为不同毒株的共有基因从不随病毒变异的病毒保守基因、超保守基因和/或保守微卫星中筛选siRNA，并以这种siRNA合成广谱抗变异毒株靶标shRNA。
[0023]进而，基于配体RBD和受体ACE2的关系设计以ACE2靶向递送shRNA的ACE2siRNA。
[0024]进而，以shRNA和ACE2合成ACE2siRNA，使之由短发夹shRNA区和双链ACE2区构成，其本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种以ACE2靶向递送shRNA的ACE2siRNA药物制备方法，其特征在于，合成以ACE2中和冠状病毒并以ACE2靶向递送冠状病毒共有RNAi序列shRNA的ACE2siRNA，包括分别合成以冠状病毒共有保守基因为RNA干扰靶标的shRNA和以冠状病毒受体结合域RBD为配体的ACE2，然后将合成的ACE2分别连接到合成的shRNA的正反义链上，构成由ACE2和shRNA组成的ACE2siRNA，经进一步的脂质体修饰，使被ACE2靶向递送的shRNA特异性间接结合病毒RBD，形成shRNA
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ACE2
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RBD
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病毒的复合物，使shRNA被复合物靶向递送并随着病毒的感染进入表达ACE2的靶细胞浆，起靶向病毒感染细胞的广谱抗病毒作用。2.根据权利要求1所述的一种以ACE2靶向递送shRNA的ACE2siRNA药物制备方法，其特征在于，所述以共有保守基因为RNA干扰靶标是指用于合成shRNA的siRNA选自数据库记载的各种致病性冠状病毒及其变异毒株的共有保守基因，使合成的shRNA靶向干扰所述共有保守基因，从而起广谱抗新冠病毒变异毒株的作用；所述共有保守基因包括但不限于超保守基因、保守基因和/或由保守微卫星拼接的基因。3.根据权利要求1、2所述的一种以ACE2靶向递送shRNA的ACE2siRNA药物制备方法，其特征在于，所述合成shRNA包括但不限于首先合成2条互补的约21
‑
25nt的siRNA寡核苷酸多肽以及合成起间隔作用的loop环碱基序列，然后将所合成的siRNA和loop环连接成由loop环间隔成的小发夹shRNA双链，继之在shRNA双链的每条单链上各连接ACE2多肽。4.根据权利要求1、3所述的一种以ACE2靶向递送shRNA的ACE2siRNA药物制备方法，其特征在于，所述合成shRNA的siRNA序列包括但不限于SEQ ID NO.1～58。5.根据权利要求1、4所述的一种以ACE2靶向递送shRNA的ACE2siRNA药物制备方法，其特征在于，所述合成shRNA的siRNA序列包括但不限于新型冠状病毒共有RNAi序列SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.8～10、SEQ ID NO.16～18、SEQ ID NO.20～22、SEQ ID NO.30～32、SEQ ID NO.41～58。6.根据权利要求1、5所述的一种以ACE2靶向递送shRNA的ACE2siRNA药物制备方法，其特征在于，所述合成shRNA的siRNA序列进一步优选为靶向冠状病毒N基因的SEQ ID NO.16
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18和SEQ ID NO.49
‑
51，靶向冠状病毒ORF1ab基因的SEQ ID NO.20
‑
22和SEQ ID NO.52
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54，以及靶向冠状病毒S基因的SEQ ID NO.30
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32和SEQ ID NO.56
‑
58；所述合成...

【专利技术属性】
技术研发人员：翁炳焕，王伟平，师越，俞光平，陈敏，杨艳梅，俞佳玲，王庭璋，杨昊堃，杨含金，
申请(专利权)人：杭州痴创生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：