一种人工抗体的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种人工抗体的制备方法，其特征在于，从冠状病毒保守基因或微卫星中筛选靶标siRNA，由两条互补的正反义siRNA链合成带loop环的小发夹shRNA，并合成以受体结合域RBD为配体的ACE2，然后将ACE2分别连接到shRNA的正反义链上，合成由shRNA区和ACE2区构成的人工抗体，其中双价ACE2起中和RBD和靶向递送shRNA的作用，shRNA通过ACE2连接病毒，并随着病毒的感染进入靶细胞，不但可避免shRNA的非特异性递送给未感染细胞的副作用，而且还能产生抗变异毒株和以ACE2中和病毒的作用，另外以两分子ACE2和1分子shRNA合成的人工抗体及shRNA的免疫佐剂作用可使ACE2具有更强的抗原性，刺激机体产生的抗

【技术实现步骤摘要】
一种人工抗体的制备方法


[0001]本专利技术涉及一种广谱抗病毒人工抗体的制备方法，属于传染病防治的生物制药领域。

技术介绍

[0002]冠状病毒的结构包括单股正链核酸(ssRNA)、刺突蛋白(S)、膜蛋白(M)、包膜蛋白(E)和核壳蛋白(N)，其中S蛋白的N端由结构域(S1
‑
NTD)和受体结合域(S1
‑
RBD)组成。
[0003]人血管紧张素转换酶II(ACE2)为靶细胞表达的I型跨膜糖蛋白，ACE2全长由805个氨基酸组成，其中第1
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740位氨基酸位于细胞膜外，称为胞外ACE2；第741
‑
763位氨基酸位于跨膜区，称为跨膜ACE2；第764
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805位氨基酸位于细胞内，称为胞内ACE2。
[0004]冠状病毒通过其S1
‑
RBD与靶细胞的ACE2结合，经胞膜融合和内吞，进入表达ACE2或含有ACE2通道的细胞。说明RBD和ACE2为配体与受体的关系，ACE2起中和RBD作用。
[0005]现有技术主要根据冠状病毒毒刺蛋白S1
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RBD设计疫苗，通过疫苗接种，使机体产生中和病毒的抗体，即免疫球蛋白(Ig)。单体Ig由两条重链(H链)和两条轻链(L链)组成。单体Ig经蛋白酶水解生成1Fc(含有两条H链的大部分)和2Fab(含有两条H链的一部分和两条L链)。接种新冠病毒RBD疫苗后产生的抗
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RBD(Ig
‑
抗
‑/>RBD)，通过Ig的2Fab结合病毒RBD，从而阻断病毒通过其RBD与靶细胞的ACE2受体结合，使病毒失去感染作用。
[0006]小干扰RNA即siRNA，以参与RNAi的方式调节基因表达,特异性降解与之互补的靶信使RNA(mRNA)。已有多种siRNA药物被FDA审批上市。但目前的siRNA药物常以某单一毒株设计、应用单链siRNA(反义RNA)制备siRNA药物或以非靶向递送载体进行siRNA药物的非特异性递送。就不断变异的冠状病毒而言，上述基于某单一毒株设计的siRNA会因冠状病毒变异而脱靶、失效，所以，应从已经变异的毒株中比对、优选出不随病毒变异而改变的各毒株共有的siRNA，用于制备针对已变异和将变异毒株的广谱siRNA药物。更重要的是，根据Hre A等报道的RNAi机制，使用由正义RNA和反义RNA混合制备的双链RNA沉默同源mRNA的效率要比使用单链RNA(反义RNA)高100倍以上，说明正确、有效的RNAi技术应采用同时包含正、反义siRNA的双链RNA(shRNNA)，而不是采用单链siRNA制备药物。
[0007]综上所述，本专利技术拟设计各变异毒株共有的siRNA，并将其合成shRNA，然后在shRNA双链末端分别连接ACE2多肽，构成ACE2
‑
shRNA
‑
ACE2的复合物，其中shRNA端相当于Ig的Fc端，2ACE2端相当于Ig的2Fab端。人工抗体就像Ig通过其2Fab结合、中和病毒RBD一样，通过其2ACE2结合、中和病毒RBD，并且人工抗体中的shRNA还起广谱抗变异毒株作用。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的是要提供一种人工抗体及其合成方法和用途，使合成抗体中的双价ACE2与病毒RBD结合形成shRNA
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2ACE2
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RBD
‑
病毒的复合物，起中和病毒和靶向递送shRNA的作用。
[0009]本专利技术的目的通过以下技术方案实施：
[0010]设计并合成shRNA，然后在shRNA的双链末端分别连接ACE2多肽，构成ACE2
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shRNA
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ACE2复合物，其中shRNA端相当于Ig的Fc端，2ACE2端相当于Ig的2Fab端。
[0011]人工抗体像Ig的Fab结合病毒RBD一样通过其ACE2结合病毒RBD，阻断病毒通过其RBD与靶细胞ACE2结合而感染靶细胞，并且其shRNA还起广谱抗变异毒株作用。
[0012]首先，根据1株冠状病毒及其18株变异毒株的全基因组设计不随病毒变异而改变的siRNA，并合成2条互补的正、反义siRNA及起间隔作用的碱基序列。
[0013]进而，将正、反义siRNA合成由中间碱基序列间隔成loop环的小发夹shRNA双链。
[0014]进而，将合成的shRNA构建干扰载体，检测其mRNA表达、蛋白表达和干扰效果，经siRNA设计、合成、筛选、迭代设计和验证，优选具有高沉默效率的siRNA。
[0015]进而，将优选的siRNA合成shRNA，包括为增加稳定性和避免脱靶进行的化学修饰。
[0016]进而，合成ACE2多肽，包括但不限于全长ACE2、跨膜ACE2、胞内ACE2、胞外ACE2，以及经氨基酸序列密码子优化的ACE2多肽。
[0017]进而，以二硫键、磷酸二酯键、二硫代磷酸脂键、硫醚键、肟键、酰胺键或马来酰亚胺
‑
巯基键等偶联方法将shRNA和ACE2连接为人工抗体(ACE2
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shRNA
‑
ACE2)；或根据shRNA的核苷酸序列和ACE2的氨基酸序列从氨基酸水平直接合成ACE2
‑
shRNA
‑
ACE2。
[0018]进而，以高效液相色谱、反向高效液相色谱或离子交换色谱进行提纯人工抗体。
[0019]进而，在体外细胞水平检测人工抗体对2种或以上不同变异毒株的抗病毒效果，观察是否具有以保守基因为靶标的广谱抗变异毒株作用；检测人工抗体在动物体内是否具有靶向递送shRNA的作用以及是否能刺激宿主产生ACE2
‑
Ab。
[0020]本专利技术的有益效果在于：
[0021]根据配体RBD和受体ACE2的相互结合关系，首次设计以ACE2中和病毒RBD并以ACE2靶向递送shRNA的人工抗体(ACE2
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shRNA
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ACE2)。人工抗体的shRNA端相当于Ig的Fc端，2ACE2端相当于Ig的2Fab端。人工抗体像Ig的Fab结合病毒RBD一样通过其ACE2结合病毒RBD，达到阻断病毒通过其RBD与靶细胞ACE2结合而感染靶细胞的目的。
[0022]通过在shRNA的双链末端分别连接ACE2多肽制备的人工抗体，由短发夹shRNA区和双链ACE2区构成，其中ACE2起递送shRNA和结合RBD的作用，结合后形成“shRNA
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ACE2
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RBD
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病毒”复合物，使shRNA随着病毒的感染进入靶细胞，这种以ACE2和病毒共同递送shRNA的新方法，可避免将shRNA非特异性递送给未感染细胞的副作用。
[0023]原本siRNA/shRNA带负电荷、脂溶性，通透性和稳定性差，将siRNA/shRNA和ACE2合成本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人工抗体的制备方法，其特征在于，合成由shRNA区和ACE2区构成的人工抗体，其中shRNA区具有靶向沉默冠状病毒mRNA的作用，而ACE2区则具有中和冠状病毒S1
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RBD和靶向递送shRNA的作用；所述shRNA以冠状病毒变异毒株的保守基因或共有基因为靶标,所述ACE2为冠状病毒受体结合域RBD的受体，所述人工抗体由shRNA的正反义链分别连接ACE2多肽制备，使人工抗体像Ig通过其Fab特异性结合抗原一样通过其ACE2结合冠状病毒S1
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RBD，构成shRNA
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ACE2
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RBD
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病毒的结合物，从而阻断病毒通过其RBD感染，或使shRNA被所述结合物中的病毒靶向递送至靶细胞，产生针对病毒感染细胞的RNAi作用。2.根据权利要求1所述的一种人工抗体的制备方法，其特征在于，所述以保守基因为靶标是指用于合成shRNA的siRNA选自数据库记载的各种致病性冠状病毒及其变异毒株的共有基因，使合成的siRNA和/或shRNA靶向干扰所述共有基因，从而起广谱抗变异毒株的作用；所述共有基因包括但不限于超保守基因、保守基因和/或由保守微卫星拼接的基因。3.根据权利要求1、2所述的一种人工抗体的制备方法，其特征在于，所述合成shRNA包括但不限于首先合成2条互补的约21
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25nt的寡核苷酸多肽siRNA以及合成起间隔作用的碱基序列，然后将所合成的siRNA和碱基序列连接成由中间碱基序列间隔成loop环的小发夹shRNA双链，继之在shRNA双链的每条单链上各连接ACE2多肽或RBD多肽。4.根据权利要求1所述的一种人工抗体的制备方法，其特征在于，所述以变异毒株保守基因或共有基因为靶标的siRNA包括但不限于SEQ ID NO.1～39。5.根据权利要求1、4所述的一种人工抗体的制备方法，其特征在于，所述以变异毒株保守基因或共有基因为靶标的siRNA包括但不限于SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7～10、SEQ ID NO.16～18、SEQ ID NO.20～22、SEQ ID NO.30～32；所述以变异毒株保守基因或共有基因为靶标的siRNA优选为SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.30。6.根据权利要求1所述的一种人...

【专利技术属性】
技术研发人员：翁炳焕，黄荷凤，贺林，王伟平，汪辉，姚旭峰，朱智勇，董旻岳，林佳丽，徐威，
申请(专利权)人：杭州痴创生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：