一种靶向药物nCoVshRNA制造技术

一种新型冠状病毒靶向药物nCoVshRNA

【技术实现步骤摘要】
一种靶向药物nCoVshRNA
·
2ACE2的合成方法


[0001]本专利技术涉及一种靶向药物nCoVshRNA
·
2ACE2的合成方法，属于生物制药领域。

技术介绍

[0002]新型冠状病毒的主要结构包括单股正链核酸(ssRNA)、刺突蛋白(S)、膜蛋白(M)、包膜蛋白(E)和核壳蛋白(N)，其中S蛋白的N端由结构域(S1
‑
NTD)和受体结合域(S1
‑
RBD)组成，新型冠状病毒通过其受体结合域S1
‑
RBD与宿主细胞受体ACE2结合引起感染。
[0003]ACE2为I型跨膜糖蛋白，由805个氨基酸组成，包括跨膜区、胞内羧基端和胞外氨基端，冠状病毒通过其S1
‑
RBD与ACE2的细胞外催化结构域互动结合，导致细胞内吞、膜融合，使病毒进入表达ACE2或含有ACE2受体的细胞。
[0004]RNA干扰(RNAi)作为一种高效的序列特异性基因沉默技术，正在给疾病的治疗带来难以想象的应用前景，已有多种siRNA药物被FDA审批上市。小干扰RNA(siRNA)大约21～23bp，以参与RNA干扰(RNAi)的方式调节基因表达,特异性降解与之互补的靶信使RNA(mRNA)，但无论是细胞水平还是活体内，使用siRNA进行基因干扰均要克服很多困难：1)膜通透性：siRNA带有大量的负电荷，分子量大(～13KD)，自身很难穿过细胞膜，运输siRNA主要靠化学修饰和一些运输载体；2)抗核酸酶降解：siRNA由大量的核糖核酸分子构成，很容易被外界的RNA酶降解，如果在设计siRNA及选择运输载体时不对碱基进行特定的化学修饰或采取载体保护方法，则在siRNA进入作用位点前即被RNA酶降解；3)靶向递送及载体：siRNA的作用位点主要在靶细胞浆内，所以需将siRNA特异性递送给靶细胞浆，如果不能有效地选用合适的靶向递送载体并及时使siRNA从内涵体释放到胞浆，通常可激活细胞免疫反应，导致干扰素等细胞因子的释放，所以，如何有效地将siRNA运输并释放到靶细胞浆是影响RNAi效果的瓶颈问题，有些siRNA能导致序列或浓度依赖性非特异性基因沉默即脱靶，因此，在设计siRNA时，应同时考虑靶向递送、基因抑制效果以及尽可能选择低脱靶效应的序列。
[0005]在COVID
‑
19的防治中，如果能以合适的靶向递送载体将nCoVsiRNA稳定地、特异地依次递送给靶器官、靶组织、靶细胞、定位于靶细胞、穿越靶细胞膜、释放到靶细胞浆，并对多种变异毒株广谱有效，就应能更好地开展COVID
‑
19的靶向基因治疗。
[0006]所以本专利技术要设计和合成一种新型冠状病毒靶向药物nCoVshRNA
·
2ACE2。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的是要提供一种以ACE2靶向递送shRNA的nCoVshRNA
·
2ACE2药物及其合成方法和用途，使双价ACE2能与RBD结合而起中和病毒和靶向递送shRNA作用，并使被ACE2靶向递送的shRNA间接结合RBD而形成“shRNA
‑
ACE2
‑
RBD
‑
病毒”的复合物，进而使shRNA被复合物靶向递送，随着病毒的感染进入靶细胞，起广谱而靶向的抗变异毒株作用。
[0008]本专利技术的目的通过以下技术方案实施：
[0009]筛选抗变异毒株靶标siRNA，合成shRNA，进而在shRNA双链末端分别延接ACE2多
肽，合成新型冠状病毒的靶向药物nCoVshRNA
·
2ACE2。
[0010]抗变异毒株靶标的筛选：从各种致病性冠状病毒及其变异毒株的共有基因中筛选siRNA，这种共有基因包括保守基因、超保守基因和/或保守微卫星，使所筛选的siRNA为不随病毒变异而改变的各变异毒株的共同靶标，使之具有广谱抗变异毒株的作用。
[0011]合成抗变异毒株靶标siRNA：将筛选的siRNA合成2条互补的21
‑
25nt的寡核苷酸siRNA，并合成起间隔作用的碱基序列。
[0012]合成shRNA：将已合成的2条互补寡核苷酸多肽siRNA和起间隔作用的碱基序列进一步合成由中间碱基序列间隔成loop环的小发夹shRNA双链。
[0013]优选siRNA：将合成的shRNA构建干扰载体，检测其mRNA表达、蛋白表达和干扰效果，经siRNA设计、合成、筛选、迭代设计和验证，优选具有高沉默效率的siRNA。
[0014]合成优选的siRNA和shRNA：采用优选的siRNA序列按上述所述合成siRNA、shRNA，包括为增加稳定性和避免脱靶进行的化学修饰。
[0015]合成ACE2多肽或蛋白：合成的ACE2包括但不限于全长ACE2、第741
‑
763位氨基酸的跨膜ACE2、第764
‑
805位氨基酸的胞内ACE2、第1
‑
740位氨基酸的胞外ACE2以及经氨基酸序列密码子优化的ACE2多肽或蛋白。
[0016]nCoVshRNA
·
2ACE2的合成：以二硫键、磷酸二酯键、二硫代磷酸脂键、硫醚键、肟键、酰胺键或马来酰亚胺
‑
巯基键等偶联方法将已合成的shRNA和ACE2连接、合成为化合物；或根据shRNA的核苷酸序列和ACE2的氨基酸序列从氨基酸水平直接合成ACE2
‑
shRNA
‑
ACE2。
[0017]nCoVshRNA
·
2ACE2的提纯：以高效液相色谱、反向高效液相色谱或离子交换色谱提纯。
[0018]nCoVshRNA
·
2ACE2的脂质体修饰：通过带负电荷的shRNA吸附带正电荷的脂质体制备脂质体修饰化合物；通过ACE2氨基的巯基化使巯基与脂质体的马来酰胺形成马来酰亚胺
‑
巯基键制备PEG内化的脂质体修饰化合物；通过ACE2氨基与脂质体形成氨甲酸酯键制备脂质体修饰化合物；通过ACE2或ACE2片段连接脂质体修饰的siRNA制备脂质体修饰化合物。
[0019]nCoVshRNA
·
2ACE2的验证：在体外细胞水平检测nCoVshRNA
·
2ACE2对2种或以上不同变异毒株的抗病毒效果，观察是否具有以保守基因为靶标的广谱抗变异毒株作用；检测其在动物体内是否具有靶向递送shRNA的作用以及是否能刺激宿主产生ACE2
‑
Ab。
[0020]本专利技术的有益效果在于：
[0021]本专利技术设计以ACE2靶向递送shRNA的siRNA药物。
[0022]本专利技术与传统siRNA药物的区别特征是：本专利技术从各种冠状病毒及其变异毒株中筛选不随病毒变异而改变的各毒株共同靶标siRNA，使这种siRNA具有广谱抗变异毒株作用。
[0本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种靶向药物nCoVshRNA
·
2ACE2的合成方法，其特征在于，将RNAi序列的正义链siRNA和反义链siRNA合成shRNA，然后在构成shRNA的正义链siRNA和/或反义链siRNA的未端延伸连接靶向载体，合成以靶向载体递送shRNA的siRNA药物。2.根据权利要求1所述的一种靶向药物nCoVshRNA
·
2ACE2的合成方法，其特征在于，所述RNAi序列为选自新冠病毒及其变异毒株的共有保守基因，使以所述RNAi序列的正、反义链siRNA合成的shRNA靶向干扰所述保守基因，从而产生广谱RNAi作用。3.根据权利要求1、2所述的一种靶向药物nCoVshRNA
·
2ACE2的合成方法，其特征在于，所述合成shRNA包括但不限于首先合成2条互补的约21
‑
25nt的siRNA，以及合成起间隔作用的碱基序列，然后将合成的siRNA和合成的碱基序列连接成由所述碱基序列间隔成中间为loop环的小发夹状shRNA，继之在shRNA的每条单链上各连接靶向载体。4.根据权利要求1、3所述的一种靶向药物nCoVshRNA
·
2ACE2的合成方法，其特征在于，合成以ACE2为载体靶向递送新型冠状病毒共有RNAi靶标shRNA的靶向药物,所述靶向递送载体为ACE2，ACE2为新冠病毒S1
‑
RBD的受体，因新冠病毒通过其S1
‑
RBD与表达在靶细胞表面的ACE2结合感染靶细胞，使合成的nCoVshRNA
·
2ACE2通过其ACE2与S1
‑
RBD的结合形成shRNA
‑
ACE2
‑
RBD
‑
病毒复合物，进而使shRNA随着病毒的感染被递送至靶细胞浆，发挥靶向RNAi作用；或通过其ACE2的靶向穿胞肽作用穿越靶细胞的ACE2通道，使shRNA被递送至靶细胞浆；或通过其ACE2与S1
‑
RBD的结合竞争抑制病毒感染靶细胞。5.根据权利要求1、4所述的一种靶向药物nCoVshRNA
·
2ACE2的合成方法，其特征在于，所述合成shRNA的siRNA包括但不限于新冠病毒RNAi序列SEQ ID NO.1～58；包括但不限于优选的新冠病毒共有序列SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.8～10、SEQ ID NO.16～18、SEQ ID NO.20～22、SEQ ID NO.30～32、SEQ ID NO.41～58。6.根据权利要求1、5所述的一种靶向药物nCoVshRNA
·
2ACE2的合成方法，其特征在于，所述合成shRNA的siRNA序列进一步优选为靶向新冠病毒N基因的SEQ ID NO.16
‑
18和SEQ ID NO.49
‑
51，靶向新冠病毒ORF1ab基因的SEQ ID NO.20
‑
22和SEQ ID NO.52
‑
54，以及靶向新冠病毒S基因的SEQ ID NO.30
‑
32和SEQ ID ...

【专利技术属性】
技术研发人员：翁炳焕，李兰娟，贺林，朱智勇，姚旭峰，汪辉，马端，师越，盛国平，俞佳玲，罗玉琴，
申请(专利权)人：杭州痴创生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：