一种通过短寡核苷酸构建含标签序列载体文库的方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种通过短寡核苷酸构建含标签序列载体文库的方法及应用。该方法需两种寡核苷酸，即定制的标签引物和可用于所有文库构建的通用引物。标签引物的中间是标签信序列，两侧是退火序列。通用引物的两侧是与标签引物退火序列互补的序列，中间为可被寄主微生物识别为碱基损伤的修饰碱基。将标签引物文库与等量的通用引物通过退火，获取引物二聚体。引物二聚体两侧为碱基配对的DNA双链，且为粘性末端。引物二聚体的中间为不配对的Ω环结构，Ω环的双链分别含有标签引物所携带的标签信息和通用引物携带的修饰碱基。引物二聚体与线性化载体连接，再转化大肠杆菌，通过细胞内源的碱基切除修复机制将Ω环的修饰碱基所在区域替换为标签序列。区域替换为标签序列。区域替换为标签序列。

【技术实现步骤摘要】
一种通过短寡核苷酸构建含标签序列载体文库的方法及应用


[0001]本专利技术属于基因工程领域，具体涉一种通过短寡核苷酸构建含标签序列载体文库的方法及应用。

技术介绍

[0002]Cas蛋白结合目标DNA依赖gRNA的碱基互补，仅需简单地改变转录得到的gRNA序列就可以定制新的靶点。利用CRISPR/Cas基因编辑技术，定制靶向基因家族或信号通路的每个成员的gRNA文库，高通量、大规模地定向创制突变体库，是功能基因组学和生物育种的重要手段。通过对Cas蛋白的修饰、宿主DNA损伤方式和修复途径的改变，高通量CRISPR技术还能实现碱基编辑、转录激活和转录抑制等突变体库的创制。实现这一技术的根本前提，是能够简单、高效和低成本地定制gRNA载体文库。
[0003]DNA条形码是指DNA上的短核苷酸序列，能给区分不同样品来源。DNA条形码可以用于高通量混合测序，在降低测序成本的同时保证了不同分子间不会相互干扰。利用DNA条形码标记不同细胞，可以追踪细胞谱系，用于发育生物学研究。
[0004]现有技术中，将标签序列引入载体中，首先需要合成较长的单链寡核苷酸(～100nt)，标签序列位于中间，两端为保守序列。再利用PCR技术，利用设计于保守序列的通用引物扩增得到双链的DNA片段。最后通过酶切/连接或同源重组技术，将双链DNA片段插入到载体中。需要合成的单链寡核苷酸的长度与成本和错误率呈正相关，且当前60nt以上(含60nt)的寡核苷酸的每个碱基的商业合成成本比59nt(含59nt)以下的高数倍。有些技术可以使用较短的引物，但仍然需要PCR获取双链DNA片段。PCR技术可能引入突变，且短片段扩增产物的回收率较低。现有技术也有使用正、负引物退火的方式得到双链的DNA片段，但是不同标签的正、负引物需要独立地退火，构建标签载体文库的操作繁琐，而且无法使用低成本的简并引物作为标签引物。

技术实现思路

[0005]针对上述问题，本专利技术提供了一种新的构建含标签序列载体文库的方法及应用，该方法中标签序列可以用作gRNA文库的靶点，因此本专利技术可以用于高通量基因编辑载体文库的创制。标签序列可以用作载体DNA的条形码，因此本专利技术可以用于带条形码载体文库的创制，并可为利用该载体文库获得的基因工程细胞赋予条形码。若标签序列位于蛋白质编码区，即可获得对蛋白质进行定点饱和突变的载体文库。
[0006]为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案为：
[0007]一种通过短寡核苷酸构建含标签序列载体文库的方法，包括：
[0008]1)预备可用于所有文库构建的通用引物；即在载体骨架和线性化方式固定的前提下，预备可用于任何类型载体文库(相同的线性化载体)的单链寡核苷酸。
[0009]2)定制中间含预设标签序列(～20nt)的标签引物；
[0010]其中，标签引物为长度60nt以下的单链寡核苷酸，其中间是欲引入载体的标签序
列，其两侧是退火序列(～15nt)；
[0011]通用引物为单链寡核苷酸(～40nt)，其中间为一个/多个尿嘧啶或其他可被寄主微生物识别为碱基损伤的修饰碱基，其两侧为标签引物退火序列的同源序列；标签引物及通用引物的两侧序列能互补配对，因此能够形成引物二聚体，即双链DNA短片段。
[0012]3)将标签引物与等量的通用引物通过同源序列间的退火，获取引物二聚体；
[0013]所述引物二聚体的两侧为碱基配对的DNA双链，且引物二聚体两端为粘性末端；引物二聚体的中间为不配对的环状结构，呈“Ω”状；“Ω”环状结构的双链分别含有标签引物所携带的标签序列和通用引物携带的修饰碱基；
[0014]4)制备两粘性末端与引物二聚体粘性末端相兼容的线性化载体；
[0015]5)将引物二聚体和线性化载体骨架通过T4 DNA连接酶连接成重组分子；其中，通过粘性末端的匹配，引物二聚体可以与线性化载体连接。
[0016]6)转化大肠杆菌，通过细胞内源的碱基切除修复机制将Ω环的修饰碱基所在区域替换为标签序列。
[0017]7)挑选单克隆，摇菌提质粒，测序验证。
[0018]进一步的，所述引物二聚体两端的粘性末端不相兼容；通过对标签引物和通用引物的设计，引物二聚体的两端将形成不相兼容的粘性末端(若粘性末端兼容，效率会大大降低)。
[0019]优选的，所述标签引物的标签序列为生物体基因组DNA的靶向序列；可用于构建a：在细胞基因组DNA指定位点造成成双链断裂的载体文库；b：在细胞基因组DNA指定位点造成单链断裂的载体文库；c：在细胞基因组DNA指定位点造成碱基损伤的载体文库；d：在细胞基因组DNA指定位点募集转录调控因子(包括激活因子、抑制因子)的载体文库。
[0020]优选的，所述标签引物的标签序列为含有简并碱基的简并引物；标签序列位于蛋白质编码区，利用简并引物在蛋白质特定位点引入变异，可用于定点饱和突变文库和噬菌体展示文库等蛋白/肽文库的构建。
[0021]进一步的，所述线性化载体通常由环状质粒被Type II限制性内切酶的双酶切或被Type IIS型限制性内切酶的单酶切而获得，其两端为互不兼容(若粘性末端兼容，效率会大大降低)且与引物二聚体的粘性末端相兼容的粘性末端。
[0022]本专利技术还提供一种鉴定转基因生物身份的方法，包括：由上述方法获得的载体文库，通过标签序列鉴定文库中的每个成员。
[0023]进一步的，具体步骤为：将上述方法获得的载体文库稳定转化细胞后，提取转化子的DNA，利用测序鉴定整合在其基因组上的标签序列，从而为每个独立转化子赋予独一无二的身份，并获取转基因拷贝数等信息。
[0024]专利技术的有益效果在于：
[0025]与需要定制100nt以上的大部分现有技术相比，针对每个标签序列，本专利技术只需要定制长度很短(<60nt)的单链的标签引物，能显著降低引物合成成本。与需要PCR的大部分现有技术相比，本专利技术使用引物退火获取携带标签序列信息的双链DNA，保真性更强，且不会因为小片段难以回收而影响建库效率。与需要单独对每对引物进行退火的现有技术相比，本专利技术使用了含修饰碱基的通用引物，简化了操作方法，还实现了使用简并引物低成本编制条形码的需求。
附图说明
[0026]为了更清楚地说明本专利技术实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0027]图1为本专利技术通过短寡核苷酸构建含标签序列载体文库的原理图。
[0028]图2为实施例中引物二聚体的二级结构；
[0029]其中，简并碱基和修饰碱基用下划线标出；小写字母代表退火序列，在本实施例中分别为水稻U3启动子的下游部分序列和sgRNA支架上游部分序列，以实现标签序列的无缝插入，针对不同的线性化载体，退火序列需要重新设计；粗体字代表粘性末端。
[003本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种通过短寡核苷酸构建含标签序列载体文库的方法，其特征在于，包括：1)预备可用于所有文库构建的通用引物；2)定制中间含预设标签序列的标签引物；其中，标签引物为长度60nt以下的单链寡核苷酸，其中间是欲引入载体的标签序列，其两侧是退火序列；通用引物为单链寡核苷酸，其中间为一个/多个尿嘧啶或其他可被寄主微生物识别为碱基损伤的修饰碱基，其两侧为标签引物退火序列的同源序列；标签引物及通用引物的两侧序列能互补配对；3)将标签引物与等量的通用引物通过同源序列间的退火，获取引物二聚体；所述引物二聚体的两侧为碱基配对的DNA双链，且引物二聚体两端为粘性末端；引物二聚体的中间为不配对的环状结构，环状结构的双链分别含有标签引物所携带的标签序列和通用引物携带的修饰碱基；4)制备两粘性末端与引物二聚体粘性末端相兼容的线性化载体；5)将引物二聚体和线性化载体骨架通过T4 DNA连接酶连接成重组分子；6)转化大肠杆菌；7)挑选单克隆，摇菌提质粒，测序验证。2.根据权利要求1所述的一种通过短寡核苷酸构建含标签序列载体文库的方法，其特征在于，所述引物二聚体两端的粘性末端不相兼容。3.根据权利要求2所述的一种通过短寡核苷酸构建含标签序列载体文库的方法，其特征在于，所述标签引物的标签序列为生物体基因组DNA的靶向序列。4.根据权利要求2所述的一种通过短寡核苷酸构建...

【专利技术属性】
技术研发人员：秦冠男，曾任森，宋圆圆，刘春梅，
申请(专利权)人：福建农林大学，
类型：发明
国别省市：