【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】核酸人工微型蛋白质组文库
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求于2020年5月26日提交的美国临时专利申请序列号63/030,056的优先权权益，所述美国临时专利申请特此通过引用整体并入。
技术介绍
[0003]富含编码开放阅读框的序列的核酸人工微型蛋白质组文库的可用性将具有许多不同的潜在应用。例如，此类文库对于生产疫苗，并且具体地是癌症疫苗是有价值的。
[0004]疫苗在治疗癌症方面有着悠久的历史。癌症疫苗通常由肿瘤抗原和免疫刺激分子(例如，细胞因子或TLR配体)组成，它们共同作用以激活识别和裂解肿瘤细胞的抗原特异性细胞毒性T细胞(CTL)。此类疫苗通常含有共有或患者特异性肿瘤抗原或全肿瘤细胞制剂。共有肿瘤抗原是免疫原性蛋白，在许多个体的肿瘤中选择性表达，并且通常作为合成肽、重组蛋白、RNA或DNA载体递送到患者。已经用于疫苗的患者特异性肿瘤抗原由具有肿瘤特异性突变的蛋白质组成，所述肿瘤特异性突变导致氨基酸序列改变。此类突变的蛋白质有可能：(a)独特地标记肿瘤(相对于非肿瘤细胞)，以便被免疫系统识别和破坏；...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种从RNA转录物群体中富集框内编码区片段文库的方法，所述方法包括：(a)将RNA转录物群体与嘌呤霉素标记的连接子多核苷酸连接，其中：所述RNA转录物群体中的RNA转录物按5
′
至3
′
顺序各自包括：(i)翻译起始位点，随后是不编码终止密码子的3个核苷酸的任何倍数；(ii)RNA序列，所述RNA序列是从来自肿瘤的cDNA序列文库中的cDNA片段序列转录的；(iii)编码多肽的核苷酸序列，所述编码多肽的核苷酸序列的长度为3个核苷酸的倍数，并且由起始于所述核苷酸序列的第一个5'核苷酸的阅读框编码，并且在所述阅读框中缺少框内终止密码子，但在另外两个阅读框中的每个阅读框中含有终止密码子；并且所述嘌呤霉素标记的连接子多核苷酸各自包括3
′
嘌呤霉素分子，其中RNA转录物的3
′
端与所述嘌呤霉素标记的连接子多核苷酸的5
′
端连接以产生嘌呤霉素标记的RNA转录物；(b)对所述嘌呤霉素标记的RNA转录物进行体外翻译反应，其中对于每个嘌呤霉素标记的RNA片段，如果从嘌呤霉素标记的RNA转录物中的cDNA片段序列转录的RNA序列与所述翻译起始位点使用相同读框，在所述阅读框内没有终止密码子并且与所述编码多肽的核苷酸序列使用相同读框，那么所述嘌呤霉素将经翻译的多肽与所述嘌呤霉素标记的RNA转录物共价连接以形成多肽连接的RNA复合物；以及(c)将所述多肽连接的RNA复合物与不处于此类复合物中的所述RNA转录物分离，由此从RNA转录物群体中富集框内编码区片段文库。2.一种从RNA转录物群体中富集框内编码区片段文库的方法，所述方法包括：(a)将RNA转录物群体与嘌呤霉素标记的连接子多核苷酸连接，其中：所述RNA转录物群体中的RNA转录物按5
′
至3
′
顺序各自包括：(i)翻译起始位点，随后是不编码终止密码子的3个核苷酸的任何倍数；(ii)编码多肽的核苷酸序列，所述编码多肽的核苷酸序列的长度为3个核苷酸的倍数，并且由起始于所述核苷酸序列的第一个5'核苷酸的阅读框编码，并且在所述阅读框中缺少框内终止密码子；(iii)RNA序列，所述RNA序列是从来自肿瘤的cDNA序列文库中的cDNA片段序列转录的；以及(iv)衔接子序列，所述衔接子序列的长度为3个核苷酸的倍数，并且在起始于所述衔接子序列的第一个5'核苷酸的阅读框中缺少终止密码子，但在另外两个阅读框中含有终止密码子，所述嘌呤霉素标记的连接子多核苷酸各自包括3
′
嘌呤霉素分子，其中RNA转录物的3
′
端与所述嘌呤霉素标记的连接子多核苷酸的5
′
端连接以产生嘌呤霉素标记的RNA转录物；(b)对所述嘌呤霉素标记的RNA转录物进行体外翻译反应，其中对于每个嘌呤霉素标记的RNA片段，如果从嘌呤霉素标记的RNA转录物中的cDNA片段序列转录的RNA序列与所述翻译起始位点使用相同读框，在所述阅读框内没有终止密码子并且与所述编码多肽的核苷酸序列使用相同读框，那么所述嘌呤霉素将经翻译的多肽与所述嘌呤霉素标记的RNA转录物共价连接以形成多肽连接的RNA复合物；以及(c)将所述多肽连接的RNA复合物与不处于此类复合物中的所述RNA转录物分离，由此
从RNA转录物群体中富集框内编码区片段文库。3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述RNA转录物群体通过以下与所述嘌呤霉素标记的连接子多核苷酸连接：(a)使所述RNA转录物与夹板多核苷酸和所述嘌呤霉素标记的连接子多核苷酸接触，其中：所述夹板多核苷酸按3
′
至5
′
顺序各自包括：(I)与所述编码多肽的核苷酸序列的3'端互补的序列；以及(II)连接子
‑
靶序列，所述嘌呤霉素标记的连接子多核苷酸按5
′
至3
′
顺序各自包括：(1)与所述连接子
‑
靶序列互补的序列；以及(2)嘌呤霉素分子，并且其中所述RNA转录物的所述编码多肽的核苷酸序列与所述与所述夹板多核苷酸的所述编码多肽的核苷酸序列的3'端互补的序列杂交，并且所述与所述连接子多核苷酸的所述连接子
‑
靶序列互补的序列与所述夹板多核苷酸的连接子
‑
靶序列杂交；(b)进行连接反应以将所述RNA转录物的3
′
端与嘌呤霉素标记的DNA连接子的5
′
端连接，以便产生嘌呤霉素标记的RNA转录物。4.根据权利要求3所述的方法，其中：(i)夹板
‑
靶序列是poly
‑
dT序列，并且与所述夹板
‑
靶序列互补的序列是poly
‑
dA序列；或者(ii)夹板
‑
靶序列是poly
‑
dA序列，并且与所述夹板
‑
靶序列互补的序列是poly
‑
dT序列。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，通过使用与由所述编码多肽的核苷酸序列编码的多肽结合的试剂亲和纯化所述多肽连接的RNA复合物，将所述多肽连接的RNA复合物与不处于此类复合物中的所述RNA转录物分离。6.根据权利要求5所述的方法，其进一步包括对经纯化的多肽连接的RNA复合物进行RT
‑
PCR扩增反应以产生包括所述cDNA片段序列的经扩增的DNA拷贝的扩增产物。7.根据权利要求6所述的方法，其进一步包括将所述扩增产物插入到克隆载体中。8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其进一步包括在步骤(a)之前通过对RNA表达构建体文库进行转录反应来产生RNA转录物文库的步骤，其中每个RNA表达构建体包括：(i)转录启动子；(ii)翻译起始位点，随后是不编码终止密码子的3个核苷酸的任何倍数；(iii)来自cDNA片段序列文库的cDNA片段序列；以及(iv)编码多肽的核苷酸序列，所述编码多肽的核苷酸序列的长度为3个核苷酸的倍数，并且由起始于所述核苷酸序列的第一个5'核苷酸的阅读框编码，并且在所述阅读框中缺少框内终止密码子，但在另外两个阅读框中的每个阅读框中含有终止密码子。9.根据权利要求8所述的方法，其中每个RNA表达构建体进一步包括衔接子序列，所述衔接子序列的长度为3个核苷酸的倍数，并且在起始于所述衔接子序列的第一个5'核苷酸的阅读框中缺少终止密码子，但在另外两个阅读框中含有终止密码子。10.根据权利要求8或权利要求9所述的方法，其中所述cDNA片段序列文库富含含外显
子组的cDNA片段。11.根据权利要求8至10中任一项所述的方法，其中所述cDNA片段序列文库富含含错配的cDNA片段序列。12.根据权利要求8至11中任一项所述的方法，其中所述翻译起始位点包括夏因
‑
达尔加诺序列(Shine
‑
Dalgarno sequence)。13.一种从来自肿瘤的细胞RNA片段群体中富集框内编码区片段文库的方法，所述方法包括：(a)对细胞RNA片段群体进行链特异性随机引发的核酸扩增反应以产生cDNA片段群体；(b)使所述cDNA片段群体与外显子组捕获探针接触，由此从所述cDNA片段群体中富集编码外显子组的cDNA片段，以产生外显子组富集的cDNA片段文库；(c)产生包括以下的RNA表达构建体：(i)转录启动子；(ii)翻译起始位点，随后是不编码终止密码子的3个核苷酸的任何倍数；(iii)来自所述外显子组富集的cDNA片段文库的外显子组富集的cDNA片段之一；(v)编码多肽的核苷酸序列，所述编码多肽的核苷酸序列的长度为3个核苷酸的倍数，并且由起始于所述核苷酸序列的第一个5'核苷酸的阅读框编码，并且在所述阅读框中缺少框内终止密码子，但在另外两个阅读框中含有终止密码子；(d)使用所述RNA表达构建体进行转录反应以产生RNA转录物文库，每个RNA转录物按5
′
至3
′
顺序包括：(i)翻译起始位点，随后是不编码终止密码子的3个核苷酸的任何倍数；(ii)RNA序列，所述RNA序列是从所述外显子组富集的cDNA片段文库中的cDNA片段序列转录的；(iii)编码多肽的核苷酸序列，所述编码多肽的核苷酸序列的长度为3个核苷酸的倍数，并且由起始于所述核苷酸序列的第一个5'核苷酸的阅读框编码，并且在所述阅读框中缺少框内终止密码子，但在另外两个阅读框中的每个阅读框中含有终止密码子，(e)将RNA转录物群体与嘌呤霉素标记的连接子多核苷酸连接，其中嘌呤霉素标记的连接子多核苷酸各自包括3
′
嘌呤霉素分子，并且RNA转录物的3
′
端与所述嘌呤霉素标记的连接子多核苷酸的5
′
端连接以产生嘌呤霉素标记的RNA转录物；(f)对所述嘌呤霉素标记的RNA转录物进行体外翻译反应，其中对于每个嘌呤霉素标记的RNA片段，如果从嘌呤霉素标记的RNA转录物中的cDNA片段序列转录的RNA序列与所述翻译起始位点使用相同读框，在所述阅读框内没有终止密码子并且与所述编码多肽的核苷酸序列使用相同读框，那么所述嘌呤霉素将经翻译的多肽与所述嘌呤霉素标记的RNA转录物共价连接以形成多肽连接的RNA复合物；以及(g)将所述多肽连接的RNA复合物与不处于此类复合物中的所述RNA转录物分离，由此从细胞RNA片段群体中富集框内编码区片段文库。14.一种从来自肿瘤的细胞RNA片段群体中富集框内编码区片段文库的方法，所述方法包括：(a)对细胞RNA片段群体进行链特异性随机引发的核酸扩增反应以产生cDNA片段群体；(b)使所述cDNA片段群体与外显子组捕获探针接触，由此从所述cDNA片段群体中富集编码外显子组的cDNA片段，以产生外显子组富集的cDNA片段文库；(c)产生包括以下的RNA表达构建体：(i)转录启动子；(ii)翻译起始位点，随后是不编
码终止密码子的3个核苷酸的任何倍数；(iii)编码多肽的核苷酸序列，所述编码多肽的核苷酸序列的长度为3个核苷酸的倍数，并且由起始于所述核苷酸序列的第一个5'核苷酸的阅读框编码，并且在所述阅读框中缺少框内终止密码子；(iv)来自所述外显子组富集的cDNA片段文库的外显子组富集的cDNA片段之一；以及(v)衔接子序列，所述衔接子序列的长度为3个核苷酸的倍数，并且在起始于所述衔接子序列的第一个5'核苷酸的所述阅读框中不含终止密码子，并且在其它阅读框中的每个阅读框中不含终止密码子；(d)使用所述RNA表达构建体进行转录反应以产生RNA转录物文库，每个RNA转录物按5
′
至3
′
顺序包括：(i)翻译起始位点，随后是不编码终止密码子的3个核苷酸的任何倍数；(ii)编码多肽的核苷酸序列，所述编码多肽的核苷酸序列的长度为3个核苷酸的倍数，并且由起始于所述核苷酸序列的第一个5'核苷酸的阅读框编码，并且在所述阅读框中缺少框内终止密码子；(iii)RNA序列，所述RNA序列是从所述外显子组富集的cDNA片段文库中的cDNA片段序列转录的；以及(iv)衔接子序列，所述衔接子序列的长度为3个核苷酸的倍数，并且在起始于所述衔接子序列的第一个5'核苷酸的阅读框中不含终止密码子，并且在其它阅读框中的每个阅读框中不含终止密码子，(e)将RNA转录物群体与嘌呤霉素标记的连接子多核苷酸连接，其中嘌呤霉素标记的连接子多核苷酸各自包括3
′
嘌呤霉素分子，并且RNA转录物的3
′
端与所述嘌呤霉素标记的连接子多核苷酸的5
′
端连接以产生嘌呤霉素标记的RNA转录物；(f)对所述嘌呤霉素标记的RNA转录物进行体外翻译反应，其中对于每个嘌呤霉素标记的RNA片段，如果从嘌呤霉素标记的RNA转录物中的cDNA片段序列转录的RNA序列与所述翻译起始位点使用相同读框，在所述阅读框内没有终止密码子并且与所述编码多肽的核苷酸序列使用相同读框，那么所述嘌呤霉素将经翻译的多肽与所述嘌呤霉素标记的RNA转录物共价连接以形成多肽连接的RNA复合物；以及(g)将所述多肽连接的RNA复合物与不处于此类复合物中的所述RNA转录物分离，由此从细胞RNA片段群体中富集框内编码区片段文库。15.根据权利要求13或14所述的方法，其中所述RNA转录物群体通过以下与所述嘌呤霉素标记的连接子多核苷酸连接：(a)使所述RNA转录物与夹板多核苷酸和所述嘌呤霉素标记的连接子多核苷酸接触，其中：所述夹板多核苷酸按3
′
至5
′
顺序各自包括：(I)与所述编码多肽的核苷酸序列的3'端互补的序列；以及(II)连接子
‑
靶序列，所述嘌呤霉素标记的连接子多核苷酸按5
′
至3
′
顺序各自包括：(1)与所述连接子
‑
靶序列互补的序列；以及(2)嘌呤霉素分子，并且其中所述RNA转录物的所述编码多肽的核苷酸序列与所述与所述夹板多核苷酸的所述编码多肽的核苷酸序列的3'端互补的序列杂交，并且所述与所述连接子多核苷酸的所述连
接子
‑
靶序列互补的序列与所述夹板多核苷酸的连接子
‑
靶序列杂交；(b)进行连接反应以将所述RNA转录物的3
′
端与嘌呤霉素标记的DNA连接子的5
′
端连接，以便产生嘌呤霉素标记的RNA转录物。16.根据权利要求15所述的方法，其中：(i)夹板
‑
靶序列是poly
‑
dT序列，并且与所述夹板
‑
靶序列互补的序列是poly
‑
dA序列；或者(ii)夹板
‑
靶序列是poly
‑
dA序列，并且与所述夹板
‑
靶序列互补的序列是poly
‑
dT序列。17.根据权利要求13至16中任一项所述的方法，其中步骤(b)进一步包括使所述cDNA片段群体与MutS蛋白接触，由此富集所述cDNA片段群体中的由于突变或单核苷酸多态性而含错配的cDNA片段。18.根据权利要求13至16中任一项所述的方法，其中步骤(b)进一步包括使所述外显子组富集的cDNA片段文库与MutS蛋白接触，由此富集所述外显子组富集的cDNA片段文库中的由于突变或单核苷酸多态性而含错配的cDNA片段。19.根据权利要求13至18中任一项所述的方法，其进一步包括由样品制备所述细胞RNA片段群体的步骤。20.根据权利要求19所述的方法，其中所述样品是肿瘤样品、正常组织样品、患病组织样品、新鲜样品、冷冻样品和/或石蜡包埋(FFPE)样品。21.根据权利要求20所述的方法，其中所述样品是石蜡包埋(FFPE)组织或肿瘤样品。22.根据权利要求17至20中任一项所述的方法，其进一步包括从受试者获得所述样品。23.根据权利要求13至22中任一项所述的方法，其中所述细胞RNA片段群体中的细胞RNA片段的长度介于150nt与250nt之间。24.根据权利要求23所述的方法，其中所述细胞RNA片段群体中的细胞RNA片段的长度为约200nt。25.根据权利要求13至24中任一项所述的方法，其中所述翻译起始位点包括夏因
‑
达尔加诺序列。26.根据权利要求1至25中任一项所述的方法，其中通过使用与由所述编码多肽的核苷酸序列编码的多肽结合的试剂亲和纯化所述多肽连接的RNA复合物，将所述多肽连接的RNA复合物与不处于此类复合物中的所述RNA转录物分离。27.根据权利要求26所述的方法，其进一步包括对经纯化的多肽连接的RNA复合物文库进行RT
‑
PCR扩增反应以产生包括所述cDNA片段序列的扩增产物。28.根据权利要求27所述的方法，其进一步包括使所述扩增产物与MutS蛋白接触，由此富集所述扩增产物中的由于突变或单核苷酸多态性而含错配的cDNA片段。29.根据权利要求27或28所述的方法，其进一步包括将所述扩增产物插入到载体中以产生包括所述cDNA片段序列的载体。30.根据权利要求29所述的方法，其中所述载体是克隆载体。31.根据权利要求29所述的方法，其中所述载体是表达载体。32.根据权利要求29所述的方法，其中所述载体是疫苗编码载体。33.根据权利要求32所述的方法，其进一步包括将所述疫苗编码载体插入到细菌中，并
且在使得所述细菌表达由所述疫苗编码载体编码的疫苗的条件下温育所述细菌。34.根据权利要求32所述的方法，其进一步包括将所述疫苗编码载体插入到酵母中，并且在使得所述酵母表达由所述疫苗编码载体编码的疫苗的条件下温育所述酵母。35.根据权利要求32所述的方法，其进一步包括使所述疫苗编码载体经受体外翻译反应，以产生由所述疫苗编码载体编码的疫苗。36.根据权利要求29所述的方法，其进一步包括将所述载体转染或转导到哺乳动物细胞中，并且在使得所述哺乳动物细胞表达由所述载体编码的疫苗的条件下温育所述哺乳动物细胞。37.根据权利要求36所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是人细胞。38.根据权利要求29所述的方法，其进一步包括将所述载体离体转染或转导到人细胞中，并且将所述人细胞递送到受试者。39.根据权利要求38所述的方法，其中所述人细胞是从同一受试者或不同受试者中分离的原代T细胞或抗原呈递细胞。40.根据权利要求29所述的方法，其进一步包括将所述载体递送到受试者，使得所述受试者表达由所述载体编码的疫苗。41.根据权利要求38至40中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。42.一种经纯化的多肽连接的RNA复合物文库，其根据权利要求26所述的方法产生。43.扩增产物，其根据权利要求27或28所述的方法产生。44.载体，其根据权利要求29所述的方法产生。45.根据权利要求44所述的载体，其中所述载体是克隆载体。46.根据权利要求44所述的载体，其中所述载体是表达载体。47.根据权利要求44所述的载体，其中所述载体是疫苗编码载体。48.一种药物组合物，其包括根据权利要求43所述的扩增产物以及药学上可接受的载体。49.一种药物组合物，其包括根据权利要求44至47中任一项所述的载体以及药学上可接受的载体。50.一种产生肿瘤疫苗的方法，所述方法包括：(a)由受试者的肿瘤样品产生细胞RNA片段；(b)对所述RNA片段进行链特异性随机引发的核酸扩增反应以产生cDNA片段；(c)使所述cDNA片段与外显子组捕获探针接触，由此从所述cDNA片段中富集编码外显子组的cDNA片段，以产生外显子组富集的cDNA片段文库；(d)产生包括以下的RNA表达构建体：(i)转录启动子；(ii)翻译起始位点，随后是不编码终止密码子的3个核苷酸的任何倍数；(iii)来自所述外显子组富集的cDNA片段文库的外显子组富集的cDNA片段之一；(iv)编码多肽的核苷酸序列，所述编码多肽的核苷酸序列的长度为3个核苷酸的倍数，并且由起始于所述核苷酸序列的第一个5'核苷酸的阅读框编码，并且在所述阅读框中缺少框内终止密码子，但在另外两个阅读框中的每个阅读框中含有终止密码子；(e)使用所述RNA表达构建体进行转录反应以产生RNA转录物文库，每个RNA转录物按5
′
至3
′
顺序包括：
(i)翻译起始位点，随后是不编码终止密码子的3个核苷酸的任何倍数；(ii)RNA序列，所述RNA序列是从所述外显子组富集的cDNA片段文库中的cDNA片段序列转录的；(iii)编码多肽的核苷酸序列，所述编码多肽的核苷酸序列的长度为3个核苷酸的倍数，并且由起始于所述核苷酸序列的第一个5'核苷酸的阅读框编码，并且在所述阅读框中缺少框内终止密码子，但在另外两个阅读框中的每个阅读框中含有终止密码子，(f)将所述RNA转录物与嘌呤霉素标记的连接子多核苷酸连接，其中嘌呤霉素标记的连接子多核苷酸各自包括3
′
嘌呤霉素分子，并且RNA转录物的3
′
端与所述嘌呤霉素标记的连接子多核苷酸的5
′
端连接以产生嘌呤霉素标记的RNA转录物；(g)对所述嘌呤霉素标记的RNA转录物进行体外翻译反应，其中对于每个嘌呤霉素标记的RNA片段，如果从嘌呤霉素标记的RNA转录物中的cDNA片段序列转录的RNA序列与所述翻译起始位点使用相同读框，在所述阅读框内没有终止密码子并且与所述编码多肽的核苷酸序列使用相同读框，那么所述嘌呤霉素将经翻译的多肽与所述嘌呤霉素标记的RNA转录物共价连接以形成多肽连接的RNA复合物；(h)使用与由所述编码多肽的核苷酸序列编码的多肽结合的试剂亲和纯化所述多肽连接的RNA复合物，以产生经纯化的多肽连接的RNA复合物文库；(i)对所述经纯化的多肽连接的RNA复合物文库进行扩增反应以产生包括所述cDNA片段序列的扩增产物；以及(j)由步骤(i)的所述扩增产物中的一种或多种扩增产物产生肿瘤疫苗。51.一种产生肿瘤疫苗的方法，所述方法包括：(a)由受试者的肿瘤样品产生细胞RNA片段；(b)对所述细胞RNA片段进行链特异性随机引发的核酸扩增反应以产生cDNA片段；(c)使所述cDNA片段与外显子组捕获探针接触，由此从所述cDNA片段中富集编码外显子组的cDNA片段，以产生外显子组富集的cDNA片段文库；(d)产生包括以下的RNA表达构建体：(i)转录启动子；(ii)翻译起始位点，随后是不编码终止密码子的3个核苷酸的任何倍数；(iii)编码多肽的核苷酸序列，所述编码多肽的核苷酸序列的长度为3个核苷酸的倍数，并且由起始于所述核苷酸序列的第一个5'核苷酸的阅读框编码，并且在所述阅读框中缺少框内终止密码子；(iv)来自所述外显子组富集的cDNA片段文库的外显子组富集的cDNA片段之一；以及(v)衔接子序列，所述衔接子序列的长度为3个核苷酸的倍数，并且在起始于所述衔接子序列的第一个5'核苷酸的阅读框中不含终止密码子，并且在其它阅读框中的每个阅读框中不含终止密码子；(e)使用所述RNA表达构建体进行转录反应以产生RNA转录物文库，每个RNA转录物按5
′
至3
′
顺序包括：(i)翻译起始位点，随后是不编码终止密码子的3个核苷酸的任何倍数；(ii)编码多肽的核苷酸序列，所述编码多肽的核苷酸序列的长度为3个核苷酸的倍数，并且由起始于所述核苷酸序列的第一个5'核苷酸的阅读框编码，并且在所述阅读框中缺少框内终止密码子；(iii)RNA序列，所述RNA序列是从所述外显子组富集的cDNA片段文库中的cDNA片段序列转录的；以及
(iv)衔接子序列，所述衔接子序列的长度为3个核苷酸的倍数，并且在起始于所述衔接子序列的第一个5'核苷酸的阅读框中不含终止密码子，并且在其它阅读框中的每个阅读框中不含终止密码子，(f)将所述RNA转录物与嘌呤霉素标记的连接子多核苷酸连接，其中嘌呤霉素标记的连接子多核苷酸各自包括3
′
嘌呤霉素分子，并且RNA转录物的3
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端...
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