【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】连接偶联PCR的方法
相关申请的交叉引用
[0001]本申请要求2020年5月15日提交的美国临时申请第63/025,738号的权益，该申请通过引用全文纳入本文。序列表
[0002]本申请包含以ASCII格式电子提交的序列表并通过引用其全部内容纳入本文。所述ASCII拷贝创建于2021年5月16日，命名为85563
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337864_SL_051621a.txt，并且大小为33,953字节。
技术介绍
[0003]通过下一代测序(NGS)进行分析的重要先决条件是制备NGS文库。在此过程中，首先可以将感兴趣的核酸片段化，如果从RNA开始可以生成cDNA，并且对于多种靶向测序工作流程，可以进行对感兴趣基因座具有特异性的多重PCR。此后，将底物端修复并连接到NGS衔接子以完成文库合成。NGS衔接子能够实现文库扩增、流动池上文库分子的克隆扩增以及测序引物的退火。NGS衔接子还掺入样本特异性索引，以允许对文库进行多重测序，同时任选地使用包含随机核苷酸(6个或更多N碱基)的标签能够实现各文库分子的独特分子条码化。NGS文库...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于连接偶联聚合酶链反应(PCR)的方法，其包括：(i)提供包含第一链和第二链的部分双链DNA底物，所述部分双链DNA底物包含第一3'突出端、双链部分和第二3'突出端，所述第一链在5'到3'方向上包含：所述部分双链DNA底物的第一5'端、第一部分和第二部分，所述第二链在5'到3'方向上包含：所述部分双链DNA底物的第二5'端、第三部分和第四部分其中所述第一链的第一部分和所述第二链的第三部分互补并形成所述双链部分，其中所述第一链的第二部分形成所述第一3'突出端，其中所述第二链的第四部分形成所述第二3'突出端，其中所述第一链的第二部分和所述第二链的第四部分各自包含分别位于所述第一3'突出端和所述第二3'突出端的5'端的第一共有核苷酸序列，和其中所述第一链的第二部分和所述第二链的第四部分各自包含位于所述第一共有核苷酸序列3'处的第二共有核苷酸序列；(ii)向所述部分双链DNA底物添加多个第一索引引物、多个第二索引引物、连接酶、DNA聚合酶和脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)以产生第一反应混合物，其中所述多个第一索引引物各自包含与所述第一共有核苷酸序列互补的第一3'末端部分，并且其中所述多个第二索引引物各自包含与所述第一共有核苷酸序列互补的第二3'末端部分和位于所述第二3'末端部分5'处且与所述第二共有核苷酸序列互补的第一5'部分；(iii)在第一组条件下孵育所述第一反应混合物，所述第一组条件包括连接温度持续连接持续时间，其中所述第一组条件足以：a)使所述第一3'末端部分退火至所述第一共有核苷酸序列，和b)使所述连接酶将所述多个第一索引引物中的一个与所述第一链的第一5'端连接，并将所述多个第一索引引物中的一个与所述第二链的第二5'端连接，以产生第二反应混合物，所述第二反应混合物包含：第三链，其在5'到3'方向上包含所述多个第一索引引物中的一个、所述第一部分和所述第二部分，和第四链，其在5'到3'方向上包含所述多个第一索引引物中的一个、所述第三部分和所述第二部分，(iv)在第二组条件下孵育所述第二反应混合物，所述第二组条件包括第一变性温度持续第一变性持续时间、第一退火温度持续第一退火持续时间和第一延伸温度持续第一延伸持续时间，其中所述第二组条件足以：a)使所述连接酶失活，使双链DNA变性，和任选地，激活所述DNA聚合酶，b)使所述多个第二索引引物中的一个的第二3'末端部分和第一5'部分退火至至少所述第三链的第二部分的第一共有核苷酸序列和第二共有核苷酸序列，并且使所述多个第二索引引物中的一个的第二3'末端部分和第一5'部分退火至至少所述第四链的第四部分的第一共有核苷酸序列和第二共有核苷酸序列，和c)使所述DNA聚合酶延伸多个第二索引引物中的一个，所述第二索引引物退火至第三链的第二部分的第一共有核苷酸序列和第二共有核苷酸序列，并使所述DNA聚合酶延伸所
述多个第二索引引物中的一个，所述第二索引引物退火至第四链的第四部分的第一共有核苷酸序列和第二共有核苷酸序列，以产生包含所述第三链、第四链、第五链和第六链的第三反应混合物，所述第五链在5'到3'方向上包含所述多个第二索引引物中的一个、所述第三部分和所述多个第一索引引物中的一个的反向互补物，所述第六链在5'到3'方向上包含所述多个第二索引引物中的一个、所述第一部分和所述多个第一索引引物中的一个的反向互补物；(v)在第三组条件下孵育所述第三反应混合物，所述第三组条件包括第二变性温度持续第二变性持续时间、第二退火温度持续第二退火持续时间和第二延伸温度持续第二延伸持续时间，其中所述第三组条件足以：a)使双链DNA变性，b)使所述多个第一索引引物中的一个退火至所述第五链的多个第一索引引物中的一个的反向互补物，并使所述多个第一索引引物中的一个退火至所述第六链的多个第一索引引物中的一个的反向互补物，和c)使所述DNA聚合酶延伸退火至所述第五链的多个第一索引引物中的一个的反向互补物的多个第一索引引物中的一个，以及退火至所述第六链的多个第一索引引物中的一个的反向互补物的多个第一索引引物中的一个，以产生包含所述第五链、第六链、第七链和第八链的第四反应混合物，所述第七链在5'至3'方向上包含所述多个第一索引引物中的一个，所述第一部分和所述多个第二索引引物中的一个的反向互补物，所述第八链在5'到3'方向上包含所述多个第一索引引物中的一个、所述第三部分和所述多个第二索引引物中的一个的反向互补物，其中所述第七链与所述第五链互补，并且其中所述第八链与所述第六链互补；和(vi)在第四组条件下孵育第四反应混合物，所述第四组条件包括第三变性温度持续第三变性持续时间、第三退火温度持续第三退火持续时间和第三延伸温度持续第三延伸持续时间，其中所述第四组条件足以使所述多个第一索引引物的至少部分和所述多个第二索引引物的至少部分扩增所述第五链和第七链以及第六链和第八链。2.如权利要求1所述的方法，其中步骤(i)至(vi)在单个封闭管中进行。3.如权利要求1所述的方法，其中，所述部分双链DNA底物具有约24个碱基至约6000个碱基的长度。4.如权利要求1所述的方法，其中，所述第一链和第二链的第一部分和第三部分分别具有约20个碱基至约6000个碱基的长度。5.如权利要求1所述的方法，其中，所述第一链的第二部分和所述第二链的第四部分各自具有约4个碱基至约100个碱基的长度。6.如权利要求1所述的方法，其中，所述第一共有核苷酸序列具有约1个碱基至约50个碱基的长度。7.如权利要求1所述的方法，其中，所述第一共有核苷酸序列具有13个碱基的长度。8.如权利要求1所述的方法，其中，所述第一共有核苷酸序列包括序列SEQ ID NO:127(5
’‑
AGATCGGAAGAGC
‑3’
)。9.如权利要求8所述的方法，其中，所述第一3'末端部分和所述第二3'末端部分各自包含序列SEQ ID NO:126(5
’‑
GCTCTTCCGATCT
‑3’
)。
10.如权利要求1所述的方法，其中，所述多个第一索引引物各自具有约20个碱基至约100个碱基的长度，并且其中所述多个第二索引引物各自具有约20个碱基至约100个碱基的长度。11.如权利要求1所述的方法，其中，所述第一共有核苷酸序列和所述第一3'末端部分的解链温度(T
m
)高于所述连接温度，并且其中所述第一共有核苷酸序列和所述第一3'末端部分的T
m
小于所述第一退火温度。12.如权利要求11所述的方法，其中，所述第一共有核苷酸序列和所述第一3'末端部分的T
m
比所述连接温度高至少1℃，并且其中所述第一共有核苷酸序列和所述第一3'末端部分的T
m
比所述第一退火温度低至少1℃。13.如权利要求1所述的方法，其中，所述第一共有核苷酸序列和所述第一3'末端部分的解链温度(T
m
)低于所述第一退火温度，并且其中所述第一共有核苷酸序列和所述第二3'末端部分的T
m
低于所述第一退火温度。14.如权利要求1所述的方法，其中，所述第二共有核苷酸序列具有约1个碱基至约100个碱基的长度。15.如权利要求1所述的方法，其中，所述第二共有核苷酸序列具有约1个碱基至约20个碱基的长度。16.如权利要求1所述的方法，其中，所述第二共有核苷酸序列具有20个碱基的长度。17.如权利要求1所述的方法，其中，所述连接温度比所述部分双链DNA底物的解链温度(T
m
)低至少1℃。18.如权利要求1所述的方法，其中，所述连接温度低于所述部分双链DNA底物的解链温度(T
m
)。19.如权利要求1所述的方法，其中，所述第三链和第四链的解链温度(T
m
)低于所述第一变性温度。20.如权利要求1所述的方法，其中，所述连接温度为约25℃至约40℃。21.如权利要求1所述的方法，其中，所述连接持续时间为约5分钟至约60分钟。22.如权利要求1所述的方法，其中，所述连接持续时间为约20分钟。23.如权利要求1所述的方法，其中，所述连接酶是能够在低镁缓冲液中连接的不耐热连接酶。24.如权利要求1所述的方法，其中，所述连接酶是T3 DNA连接酶。25.如权利要求24所述的方法，其中，所述连接酶以每50μL第一反应混合物约30至约300酶单位添加。26.如权利要求1所述的方法，其中，所述连接酶是温度敏感的，并且其中步骤(iv)(a)中所述第一变性温度持续第一变性持续时间足以使所述连接酶失活。27.如权利要求1所述的方法，其中，所述DNA聚合酶是具有3'
‑
5'外切核酸酶校对活性的热稳定DNA聚合酶，其选自下组：Kapa HiFi DNA聚合酶(罗氏公司)，NEB Q5 DNA聚合酶(NEB公司)，PrimeStar GXL DNA聚合酶(宝生物公司)和高保真DNA聚合酶(凯杰公司)。28.如权利要求1所述的方法，其中，所述DNA聚合酶在连接温度下没有活性。29.如权利要求28所述的方法，其中，所述DNA聚合酶还包含热启动抗体或适体，并且其中所述热启动抗体或适体增加所述DNA聚合酶的激活温度。
30.如权利要求29所述的方法，其中，所述DNA聚合酶选自下组：Kapa HiFi热启动DNA聚合酶(罗氏公司)、NEB Q5热启动DNA聚合酶(NEB公司)，PrimeStar GXL热启动DNA聚合酶(宝生物公司)和高保真热启动DNA聚合酶(凯杰公司)。31.如权利要求1所述的方法，其中，所述DNA聚合酶是热启动聚合酶，并且其中步骤(iv)(a)中所述第一变性温度持续第一变性持续时间足以激活所述热启动聚合酶。32.如权利要求1所述的方法，其中，所述多个第二索引引物中的每一个以及所述第一链和第二链的第二部分或第四部分各自的解链温度(T
m
)高于所述多个第一索引引物中的每一个以及所述第一链和第二链的第二部分或第四部分的T
m
。33.如权利要求1所述的方法，其中，所述第一变性温度、第二变性温度和第三变性温度各自独立地为约95℃至约98℃。34.如权利要求1所述的方法，其中，所述第一变性持续时间、第二变性持续时间和第三变性持续时间各自独立地为约30秒至约2分钟。35.如权利要求1所述的方法，其中，所述第一退火温度、第二退火温度和第三退火温度各自独立地为约55℃至约65℃。36.如权利要求1所述的方法，其中，所述第一退火持续时间、第二退火持续时间和第三退火持续时间各自独立地为约10秒至约60秒。37.如权利要求1所述的方法，其中，所述第一延伸温度、第二延伸温度和第三延伸温度各自独立地为约62℃至约72℃。38.如权利要求1所述的方法，其中，所述第一延伸持续时间、第二延伸持续时间和第三延伸持续时间各自独立地为约30秒至约5分钟。39.如权利要求1所述的方法，其中，所述多个第一索引引物和所述多个第二索引引物各自以约100nM至约1μM独立地添加到所述第一反应混合物中。40.如权利要求1所述的方法，其中，所述多个第一索引引物和所述多个第二索引引物各自以约100nM至约200nM独立地添加到所述第一反应混合物中。41.如权利要求1所述的方法，其中，步骤(ii)还包括向所述第一反应混合物添加阻断子寡核苷酸，其中所述阻断子寡核苷酸包含5'部分，所述5'部分与所述多个第二索引引物中的每一个的第二3'末端部分的至少部分互补，其中所述阻断子寡核苷酸和所述多个第二索引引物中的每一个的解链温度(T
m
)高于连接温度且低于所述第一退火温度和所述第三退火温度。42.如权利要求41所述的方法，其中，所述阻断子寡核苷酸和所述多个第二索引引物中的每一个的T
m
高于所述阻断子寡核苷酸和所述多个第一索引引物中的每一个的T
m
。43.如权利要求41所述的方法，其中，所述阻断子寡核苷酸以足以抑制所述多个第二索引引物中的每一个与所述第一链的第一5'端和所述第二链的第二5'端的连接的量添加。44.如权利要求41所述的方法，其中，所述阻断子寡核苷酸以所述多个第二索引引物的量的1X、1.5X、2X、4X或6X的量添加。45.如权利要求41所述的方法，其中，所述阻断子寡核苷酸预退火至所述多个第二索引引物中的每一个。46.如权利要求41所述的方法，其中，所述阻断子寡核苷酸包含位于5'部分3'的第一附加部分，其与所述多个第二索引引物中的每一个互补并且与所述多个第一索引引物中的每
一个不互补。47.如权利要求46所述的方法，其中，所述第一附加部分和5'部分和所述多个第二索引引物中的每一个之间的解链温度(T
m
)是大约相同或高于5'部分和所述多个第一索引引物中的每一个和所述多个第二索引引物中的每一个之间的解链温度。48.如权利要求47所述的方法，其中，所述第一附加部分和5'部分和所述多个第二索引引物中的每一个之间的T
m
比5'部分和所述多个第一索引引物中的每一个和所述多个第二索引引物中的每一个之间的解链温度高至少1℃。49.如权利要求46
‑
48中任一项所述的方法，其中，所述阻断子寡核苷酸还包含位于所述5'部分和所述第一附加部分之间的第二附加部分，其中所述第二附加部分与所述多个第一索引引物中的每一个不互补并且与所述多个第二索引引物中的每一个不互补。50.如权利要求49所述的方法，其中，所述第二附加部分具有约1个碱基至约30个碱基的长度。51.如权利要求41所述的方法，其中，所述阻断子寡核苷酸包含与所述第二索引引物中的每一个不互补的序列。52.如权利要求51所述的方法，其中，所述与多个第二索引引物中的每一个不互补的序列具有约1至约30个碱基的长度。53.如权利要求41所述的方法，其中，所述阻断子寡核苷酸还包含3'修饰以阻断聚合酶延伸。54.如权利要求53所述的方法，其中，所述3'修饰以阻断聚合酶延伸选自下组：C3碳间隔子，己二醇，间隔子9，间隔子18，磷酸，2',3'
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双脱氧核苷ddA，ddT，ddC和ddG，3'
‑
脱氧核苷3'
‑
A，3'
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T，3'
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C和3'
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G，RNA核苷酸，例如rU，3
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O
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甲基核苷酸，或与相邻引物序列不互补的DNA序列，例如多聚T，多聚A，多聚C和多聚G，并且还包含核酸酶抗性连接，以防止校对聚合酶的3'
‑
5'核酸外切酶活性去除与相邻引物序列不互补的DNA序列。55.如权利要求41所述的方法，其中，所述阻断子寡核苷酸和所述多个第一索引引物中的每一个之间的解链温度(T
m
)低于所述阻断子寡核苷酸和所述多个第二索引引物中的每一个之间的T
m
。56.如权利要求55所述的方法，其中，所述阻断子寡核苷酸和所述多个第一索引引物中的每一个之间的T
m
比所述阻断子寡核苷酸和所述多个第二索引引物中的每一个之间的T
m
低至少5℃。57.如权利要求41所述的方法，其中，所述阻断子寡核苷酸的5'部分包含序列SEQ ID NO:127。58.如权利要求46
‑
50中任一项所述的方法，其中，所述阻断子寡核苷酸还包含3'羟基基团和位于所述第一附加部分3'的发夹部分，其中所述发夹部分包含第一发夹序列和第二发夹序列，其中所述第一发夹序列位于所述第二发夹序列的5'，其中所述第一发夹序列和所述第二发夹序列是互补的，并且其中所述发夹部分具有高于所述第一退火温度、第二退火温度和第三退火温度的解链温度。59.如权利要求58所述的方法，其中，所述发夹部分还包含位于所述第一发夹序列和所述第二发夹序列之间的第三发夹序列。60.如权利要求59所述的方法，其中，所述第三发夹序列形成环，其足以允许由所述发
夹部分和所述第一附加部分形成稳定的茎环结构。61.如权利要求60所述的方法，其中，所述第三发夹序列具有约4个碱基至约20个碱基的长度。62.如权利要求58所述的方法，其中，所述发夹部分的解链温度高于所述5'部分和所述多个第二索引引物中的每一个、附加部分和多个第二索引引物中的每一个或两者之间的解链温度。63.权利要求58
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60中任一项所述的方法，其中所述第二组条件进一步足以使所述DNA聚合酶延伸所述阻断子寡核苷酸的3'端，以产生延伸的发夹阻断子。64.如权利要求63所述的方法，其中，所述延伸的发夹阻断子的解链温度(T
m
)高于所述第二退火温度和所述第三退火温度。65.如权利要求63所述的方法，其中，所述延伸的发夹阻断子具有稳定的二级结构。66.如权利要求63所述的方法，其中，所述延伸的发夹阻断子的解链温度(T
m
)高于所述5'部分和所述第一附加部分至所述多个第二索引引物中的每一个的T
m
。67.如权利要求1所述方法，其中，所述多个第一索引引物各自还包含序列SEQ ID NO:87。68.如权利要求1所述方法，其中，所述多个第二索引引物各自还包含序列SEQ ID NO:78。69.如前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括对所述第五链和第七链或第六链和第八链进行测序。70.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多个第一索引引物中的每一个包含第一5'末端部分并且所述多个第二索引引物中的每一个还包含第二5'末端部分，其中所述第一5'末端部分和所述第二5'末端部分各自在5'到3'方向上包括包含两个或更多个脱氧核苷酸的第一序列和包含三个或更多个核糖核苷酸的第二序列，其中所述DNA聚合酶具有3'到5'外切核酸酶活性，由此所述第五链和第六链还包含位于所述第五链和第六链的5'端的第二5'末端部分，并且由此所述第七链和第八链还包含位于所述第七链和第八链的5'端的第一5'末端部分，并且由此所述第五链和第七链能够形成具有第一5'突出端和第二5'突出端的第一双链产物，并且由此所述第六链和第八链能够形成具有第三5'突出端和第四5'突出端的第二双链产物，所述方法还包括：以足以产生目标摩尔量的所述第五链、第六链、第七链和第八链的量添加探针和第二连接酶，所述探针与所述第一5'突出端、第二5'突出端、第三5'突出端和第四5'突出端互补，其中所述第五链、第六链、第七链和第八链以大于所述目标摩尔量的量存在，其中所述探针包含修饰以提供对具有3'外切核酸酶活性的酶消化的抗性；在足以使所述探针与所述目标摩尔量的第五链、第六链、第七链和第八链连接的条件下，孵育所述第五链、第六链、第七链、第八链、第二连接酶和探针，以产生预标准化反应混合物；向所述预标准化反应混合物添加具有3'外切核酸酶活性的酶；在足以使具有3'外切核酸酶活性的酶消化未连接到所述探针的第五链、第六链、第七链和第八链的条件下，孵育所述预标准化反应混合物和具有外切核酸酶活性的酶，以产生标准化的下一代测序(NGS)文库。
71.如权利要求70所述的方法，还包括对所述标准化的NGS文库进行测序。72.一种用于连接偶联PCR的方法，其包括：(i)提供包含第一链和第二链的部分双链DNA底物，所述部分双链DNA底物包含第一3'突出端、双链部分和第二3'突出端，第一链，其在5'到3'方向上包含第一5'端、第一部分和第二部分，第二链，其在5'到3'方向上包含第二5'端、第三部分和第四部分，其中所述第一链的第一部分和所述第二链的第三部分互补并形成所述双链部分，其中所述第一链的第二部分形成所述第一3'突出端，其中所述第二链的第四部分形成所述第二3'突出端，其中所述第一链的第二部分和所述第二链的第四部分各自包含分别位于所述第一3'突出端和所述第二3'突出端的5'端的第一共有核苷酸序列，和其中所述第一链的第二部分和所述第二链的第四部分各自包含位于所述第一共有核苷酸序列3'处的第二共有核苷酸序列；(ii)将多个第一索引引物、多个第二索引引物、多个5'衔接子、连接酶、DNA聚合酶和脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)添加到部分双链DNA底物，以产生第一反应混合物，其中所述多个第一索引引物各自包含与所述第一共有核苷酸序列不互补的第一3'末端部分，其中所述多个第二索引引物各自包含与所述第一共有核苷酸序列不互补的第二3'末端部分，其中所述第二3'末端序列与所述第二共有核苷酸序列互补，并且其中所述多个5'衔接子各自包含与第一共有核苷酸序列互补的第三3'末端序列，位于所述第三3'末端序列5'的第一5'部分，其包含所述多个第一索引引物中的每一个的第一3'末端部分的至少部分，位于第一5'部分5'并与所述第一5'部分互补的第二5'部分，以及能够阻断位于所述第一5'部分5'端的DNA聚合酶的复制阻断子，并且其中所述5'衔接子能够通过使所述第一5'部分与所述第二5'部分退火来形成发夹；(iii)在第一组条件下孵育所述第一反应混合物，所述第一组条件包括连接温度持续连接持续时间，其足以：1)使所述第三3'末端部分退火至第一共有核苷酸序列，和2)使连接酶将多个5'衔接子中的一个与第一链的第一5'端和第二链的第二5'端连接，以产生第二反应混合物，其包含：第三链，其在5'到3'方向上包含所述多个5'衔接子中的一个、所述第一部分和所述第二部分，和第四链，其在5'到3'方向上包含所述多个5'衔接子中的一个、所述第三部分和所述第四部分，(iv)在第二组条件下孵育所述第二反应混合物，所述第二组条件包括第一变性温度持续第一变性持续时间、第一退火温度持续第一退火持续时间和第一延伸温度持续第一延伸持续时间，其足以：a)使所述连接酶失活，使双链DNA变性，和任选地，激活所述DNA聚合酶，b)使所述多个第二索引引物中的一个的第二3'末端部分退火至所述第三链的第二部分的第二共有核苷酸序列并使所述多个第二索引引物中的一个退火至所述第四链的第四部分的第二共有核苷酸序列，c)使所述DNA聚合酶延伸退火至所述第三链的第二部分的第二共有核苷酸序列的多个
第二索引引物中的一个并延伸退火至第四链的第四部分的第二共有核苷酸序列的多个第二索引引物中的一个，以产生包含第三链、第四链、第五链和第六链的第三反应混合物，所述第五链在5'至3'方向上包含所述多个第二索引引物中的一个，所述第三部分，所述第一共有核苷酸序列的反向互补物，和所述多个5'衔接子中的一个的第一5'部分的反向互补物，和所述第六链在5'到3'方向上包含所述多个第二索引引物中的一个，所述第一部分，所述第一共有核苷酸序列的反向互补物，和所述多个5'衔接子中的一个的第一5'部分的反向互补物，(v)在第三组条件下孵育所述第三反应混合物，所述第三组条件包括第二变性温度持续第二变性持续时、第二退火温度持续第二退火持续时间、第二延伸温度持续第二延伸持续时间，其足以：a)使任何双链DNA变性，b)使所述多个第一索引引物中的一个的第一3'末端部分退火至所述第五链的多个5'衔接子中的一个的第一5'部分的反向互补物并使所述多个第一索引引物中的一个退火至所述第六链的多个5'衔接子中的一个的第一5'部分的反向互补物，c)使所述DNA聚合酶延伸退火至所述第五链的多个5'衔接子中的一个的第一5'部分的反向互补物的多个第一索引引物中的一个，并延伸退火至所述第六链的多个5'衔接子中的一个的第一5'部分的反向互补物的多个第一索引引物中的一个，以产生包含第五链、第六链、第七链和第八链的第四反应混合物，所述第七链在5'到3'方向上包含所述多个第一索引引物中的一个、第一共有核苷酸序列、第一部分和所述多个第二索引引物中的一个的反向互补物，和所述第八链在5'至3'方向上包含所述多个第一索引引物中的一个、第一共有核苷酸序列、第三部分、所述多个第二索引引物中的一个的反向互补物；(vi)在第四组条件下孵育所述第四反应混合物，所述第四组条件包括第三变性温度持续第三变性持续时间、第三退火温度持续第三退火持续时间和第三延伸温度持续第三延伸持续时间，其足以：a)使任何双链DNA变性，b)使所述多个第二索引引物中的一个退火至所述第七链的多个第二索引引物中的一个的反向互补物，并使所述多个第二索引引物中的一个退火至所述第八链的多个第二索引引物中的一个的反向互补物，和c)使所述DNA聚合酶延伸退火至所述第七链和第八链中的每一个的多个第二索引引物中的一个，以产生包含第七链、第八链、第九链和第十链的第五反应混合物，所述第九链在5'到3'方向上包含所述多个第二索引引物中的一个，第三部分，所述第一共有核苷酸序列的反向互补物，和所述多个第一索引引物中的一个的反向互补物，和所述第十链在5'到3'方向上包含所述多个第二索引引物中的一个，第一部分，所述第一共有序列的反向互补物，和所述多个第一索引引物中的一个的反向互补物，其中所述第七链和第九链互补并且其中所述第八链和第十链互补；和(vii)在第五组条件下孵育所述第五反应混合物，所述第五组条件包括第四变性温度持续第四变性持续时间、第四退火温度持续第四退火持续时间和第四延伸温度持续第四延伸持续时间，其足以使所述多个第一索引引物的至少部分、所述多个第二索引引物的至少部分和所述DNA聚合酶扩增所述第七链和第九链和第八链和第十链。
73.如权利要求72所述的方法，其中步骤(i)至(vii)在单个封闭管中进行。74.如权利要求72所述的方法，其中，所述第一5'部分和所述第二5'部分各自具有约12个碱基至约20个碱基的长度。75.如权利要求72所述的方法，其中，所述多个5'衔接子中的每一个还包含所述第一5'部分和所述第二5'部分之间的间插序列。76.如权利要求75所述的方法，其中，所述间插序列具有约4个碱基至约20个碱基的长度。77.如权利要求72所述的方法，其中，所述复制块选自下组：稳定的脱碱基位点，C3间隔子，己二醇，间隔子9，间隔子18，3或更多个rU碱基和2'
‑
O
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甲基RNA碱基。78.如权利要求72所述的方法，其中，所述多个5'衔接子各自具有约25个碱基至约100个碱基的长度。79.如权利要求72所述的方法，其中，所述部分双链DNA底物具有约24个碱基至约6000个碱基的长度。80.如权利要求72所述的方法，其中，所述第一链和第二链的第一部分和第三部分分别具有约20个碱基至约6000个碱基的长度。81.如权利要求72所述的方法，其中，所述第一链的第二部分和所述第二链的第四部分各自具有约4个碱基至约100个碱基的长度。82.如权利要求72所述的方法，其中，所述第一共有核苷酸序列具有约1个碱基至约50个碱基的长度。83.如权利要求72所述的方法，其中，所述第一共有核苷酸序列具有13个碱基的长度。84.如权利要求72所述的方法，其中，所述第一共有核苷酸序列包括序列SEQ ID NO:127。85.如权利要求84所述的方法，其中，所述多个5'衔接子中的每一个的第三3'末端部分包含序列SEQ ID NO:126。86.如权利要求72所述的方法，其中，所述多个第一索引引物各自具有约20个碱基至约100个碱基的长度，并且其中所述多个第二索引引物各自具有约20个碱基至约100个碱基的长度。87.如权利要求72所述的方法，其中，所述第一共有核苷酸序列和所述第三3'末端部分的解链温度大于所述连接温度。88.如权利要求72所述的方法，其中，所述第二共有核苷酸序列和所述多个第二索引引物各自的第二3'末端部分的解链温度高于第一退火温度。89.如权利要求72所述的方法，其中，所述第一共有核苷酸序列和所述第三3'末端部分的解链温度比所述连接温度高至少1℃，并且其中所述第一共有核苷酸序列和所述第三3'末端部分的解链温度比所述第一退火温度低至少1℃。90.如权利要求72所述的方法，其中，所述第二共有核苷酸序列具有约1个碱基至约100个碱基的长度。91.如权利要求72所述的方法，其中，所述第二共有核苷酸序列具有约1个碱基至约20个碱基的长度。92.如权利要求72所述的方法，其中，所述第二共有核苷酸序列包括序列SEQ ID NO:
95。93.如权利要求72所述的方法，其中，所述连接温度低于所述部分双链DNA底物的解链温度。94.如权利要求72所述的方法，其中，所述第三链和第四链的解链温度低于所述第一变性温度。95.如权利要求72所述的方法，其中，所述连接温度为约25℃至约40℃。96.如权利要求72所述的方法，其中，所述连接持续时间为约5分钟至约60分钟。97.如权利要求72所述的方法，其中，所述连接持续时间为约20分钟。98.如权利要求72所述的方法，其中，所述连接酶是能够在低镁缓冲液中连接的不耐热连接酶。99.如权利要求72所述的方法，其中，所述连接酶是T3 DNA连接酶。100.如权利要求99所述的方法，其中，所述连接酶以每50μL第一反应混合物约30至约300酶单位添加。101.如权利要求72所述的方法，其中，所述连接酶是温度敏感的，并且其中所述第一变性温度持续第一变性持续时间足以使所述连接酶失活。102.如权利要求72所述的方法，其中，所述DNA聚合酶选自下组：Kapa HiFi DNA聚合酶(罗氏公司)，NEB Q5 DNA聚合酶(NEB公司)，PrimeStar GXL DNA聚合酶(宝生物公司)和高保真DNA聚合酶(凯杰公司)。103.如权利要求72所述的方法，其中，所述DNA聚合酶在连接温度下没有活性。104.如权利要求103所述的方法，其中，所述DNA聚合酶还包含热启动抗体或适体，并且其中所述热启动抗体或适体增加所述DNA聚合酶的激活温度。105.如权利要求104所述的方法，其中，所述DNA聚合酶选自下组：Kapa HiFi热启动聚合酶(罗氏公司)，NEB Q5热启动DNA聚合(NEB公司)，PrimeStar GXL热启动DNA聚合酶(宝生物公司)和高保真热启动DNA聚合酶(凯杰公司)。106.如权利要求72所述的方法，其中，所述DNA聚合酶是热启动聚合酶，并且其中所述第一变性温度持续第一变性持续时间足以激活所述热启动聚合酶。107.如权利要求72所述的方法，其中，所述第一变性温度、第二变性温度、第三变性温度和第四变性温度各自独立地为约95℃至约98℃。108.如权利要求72所述的方法，其中，所述第一变性持续时间、第二变性持续时间和第三变性持续时间各自独立地为约30秒至约2分钟。109.如权利要求72所述的方法，其中，所述多个第一索引引物和所述多个第二索引引物各自以约100nM至约1μM独立地添加到所述第一反应混合物中。110.如权利要求72所述的方法，其中，所述多个第一索引引物和所述多个第二索引引物各自以约100nM至约200nM独立地添加到所述第一反应混合物中。111.如权利要求72所述的方法，其中，所述第一退火温度、第二退火温度、第三退火温度和第四退火温度各自独立地为约55℃至约65℃。112.如权利要求72所述的方法，其中，所述第一退火持续时间、第二退火持续时间、第三退火持续时间和第四退火持续时间各自独立地为约10秒至约60秒。113.如权利要求72所述的方法，其中，所述第一延伸温度、第二延伸温度、第三延伸温
度和第四延伸温度各自独立地为约60℃至约72℃。114.如权利要求72所述的方法，其中，所述第一延伸持续时间、第二延伸持续时间、第三延伸持续时间和第四延伸持续时间各自独立地为约30秒至约5分钟。115.如权利要求72所述方法，其中，所述多个第一索引引物各自还包含序列SEQ ID NO:87。116.如权利要求72所述方法，其中，所述多个第二索引引物各自还包含序列SEQ ID NO:78。117.如权利要求72
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116中任一项所述的方法，其还包括对所述第七链和第九链或第八链和第十链进行测序。118.如权利要求72
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117中任一项所述的方法，其中所述多个第一索引引物中的每一个包含第一5'末端部分并且所述多个第二索引引物中的每一个还包含第二5'末端部分，其中所述第一5'末端部分和所述第二5'末端部分各自在5'到3'方向上包括包含两个或更多个脱氧核苷酸的第一序列和包含三个或更多个核糖核苷酸的第二序列，其中所述DNA聚合酶具有3'到5'外切核酸酶活性，由此所述第七链和第八链还包含位于所述第七链和第八链的5'端的第一5'末端部分，并且由此所述第九链和第十链还包含位于所述第九链和第十链的5'端的第二5'末端部分，并且由此所述第七链和第九链能够形成具有第一5'突出端和第二5'突出端的第一双链产物，并且由此所述第八链和第十链能够形成具有第三5'突出端和第四5'突出端的第二双链产物，所述方法还包括：以足以产生目标摩尔量的所述第七链、第八链、第九链和第十链的量添加探针和第二连接酶，所述探针与所述第一5'突出端、第二5'突出端、第三5'突出端和第四5'突出端互补，其中所述第七链、第八链、第九链和第十链以大于所述目标摩尔量的量存在，其中所述探针包含修饰以提供对具有3'外切核酸酶活性的酶消化的抗性；在足以使所述探针与所述目标摩尔量的第七链、第八链、第九链和第十链连接的条件下，孵育所述第七链、第八链、第九链、第十链、连接酶和探针，以产生预标准化反应混合物；向所述预标准化反应混合物添加具有3'外切核酸酶活性的酶；在足以使具有3'外切核酸酶活性的酶消化未连接到所述探针的第七链、第八链、第九链和第十链的条件下，孵育所述预标准化反应混合物和具有外切核酸酶活性的酶，以产生标准化的下一代测序(NGS)文库。119.如前述权利要求中任一项所述的方法，其在步骤(i)前还包括：提供包含第一起始链和第二起始链的起始双链DNA底物分子，其中所述起始双链DNA底物分子的第一起始链包括位于所述第一起始链的5'端的通用引物序列，其中所述通用引物序列包含位于所述通用引物序列内部或所述通用引物序列的3'端的dU碱基，其中所述起始双链DNA底物分子的第二起始链包括位于所述第二起始链的5'端的通用引物序列；添加能够切割所述起始双链DNA底物分子的dU碱基的酶；和在足以产生步骤(i)的部分双链DNA底物的条件下，孵育能够切割dU碱基的酶和起始双链DNA底物分子。120.如权利要求119所述的方法，其中，所述能够切割dU碱基的酶是尿嘧啶DNA糖基化酶和内切核酸酶VIII的组合。121.如权利要求1
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118中任一项所述的方法，其在步骤(i)前还包括：
提供包含第一起始链和第二起始链的起始双链DNA底物分子，其中所述起始双链DNA底物分子的第一起始链包含第一5'可切割序列，其包含位于所述第一5'可切割序列内部或所述第一5'可切割序列的3'端的核糖核苷酸，其中双链DNA底物分子的第二起始链包含第二5'可切割序列，其包含位于所述第二5'可切割序列内部或所述第二5'可切割序列的3'末的核糖核苷酸；添加能够切割所述第一5'可切割序列和所述第二5'可切割序列的核糖核苷酸的酶；在足以产生步骤(i)的部分双链DNA底物的条件下，孵育能够切割所述第一5'可切割序列和所述第二5'可切割序列的核糖核苷酸的酶和所述起始双链DNA底物分子。122.如权利要求121所述的方法，其中，所述能够切割所述第一5'可切割序列和所述第二5'可切割序列的核糖核苷酸的酶是RNA酶H。123.如权利要求1
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118中任一项所述的方法，其在步骤(i)前还包括：提供包含第一起始链和第二起始链的起始双链DNA底物分子，其中所述起始双链DNA底物分子的第一起始链包含第一5'可切割序列，其包含位于所述第一5'可切割序列内部或所述第一5'可切割序列的3'端的肌苷碱基，其中双链DNA底物分子的第二起始链包含第二5'可切割序列，其包含位于所述第二5'可切割序列内部或所述第二5'可切割序列的3'端的肌苷碱基；添加能够切割所述第一5'可切割序列和所述第二5'可切割序列的肌苷碱基的酶；在足以产生步骤(i)的部分双链DNA底物的条件下，孵育能够切割所述第一5'可切割序列和所述第二5'可切割序列的肌苷碱基的酶和所述起始双链DNA底物分子。124.如权利要求121所述的方法，其中，所述能够切割肌苷碱基的酶是内切核酸酶V。125.如权利要求1
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118中任一项所述的方法，其还包括：提供片段化的DNA底物分子；进行末端修复以产生包含第一起始链和第二起始链的钝端双链起始DNA底物分子，所述第一起始链和第二起始链各自包含5'末端和3'末端；向所述钝端双链起始DNA底物分子添加多个包含5'磷酸的3'衔接子链，退火至包含dU碱基和3'阻断基团的互补链的各3'衔接子链，和连接酶；在足以使所述多个3'衔接子链中的一个与所述钝端起始DNA底物分子的第一链和第二链的各个3'端连接并在各互补链和所述第一起始链和第二起始链的各个5'端之间留下缺口的条件下，孵育退火至包含dU碱基的互补链的多个3'衔接子链、所述连接酶和所述钝端双链DNA底物分子，以产生连接的双链底物分子；任选地，纯化所述连接的双链底物分子；向所述连接的双链底物分子添加能够切割所述连接的双链底物分子的dU碱基的酶；和在足以切割所述互补链的条件下，孵育能够切割dU碱基的酶和所述连接的双链底物分子，以产生步骤(i)的部分双链DNA底物。126.如权利要求125所述的方法，其中，所述能够切割...
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