被称为“CTL-seq”(CRISPRTagLinear-seq)的核酸酶中靶/脱靶编辑位点的提名方法技术

一种以提高的准确性和灵敏度鉴定和提名中靶和脱靶CRISPR编辑位点特别是Cas9的方法，其中在双链断裂处插入标签，包含所述标签与通用接头的区域包含独特分子索引(UMI)。通用测序引物结合的序列可以预先设计。一种设计52个碱基对的标签序列的方法，所述方法基于：(a)随机生成13个核苷酸的序列，其具有40

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】被称为“CTL
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seq”(CRISPR Tag Linear
‑
seq)的核酸酶中靶/脱靶编辑位点的提名方法
[0001]与相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2020年7月23日提交的美国临时专利申请号63/055,460的优先权，所述临时申请整体通过参考并入本文。
[0003]对序列表的参考
[0004]根据37 C.F.R.
§
1.821(c)，本申请与计算机可读形式的序列表一起提交。所述通过EFS提交的文本“013670
‑
9056
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WO01_sequence_listing_19
‑
JUL
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2021_ST25.txt”含有273个序列，于2021年7月19日创建，文件大小为153千字节，并整体通过参考并入本文。


[0005]本文描述了以提高的准确性和灵敏度鉴定和提名中靶和脱靶CRISPR编辑位点的方法。

技术介绍

[0006]CRISPR(规律成簇间隔短回文重复序列)通过允许简单地引入遗传密码的变化而革新了基因组学。CRISPR系统例如Cas9和Cas12a蛋白被与Cas蛋白结合的RNA寡核苷酸序列(形成核糖核蛋白；RNP)引导到它们的靶，在那里所述酶在DNA序列中产生双链断裂(DSB)。天然细胞机制通常使用非同源末端连接(NHEJ)或同源性指导的修复(HDR)分子途径修复DSB。通过在中靶和脱靶位置处发生的NHEJ修复的DNA通常含有插入缺失(插入/缺失)，其可以引起突变并改变编码基因的功能。因此，鉴定这些位置对于反推中靶和脱靶编辑对生物学表型的影响是关键的。
[0007]迄今为止，尚不存在为CRISPR或其他核酸酶鉴定或提名脱靶编辑位点的“金标准”方法。已开发了许多方法。这些方法使用各种不同的策略，包括检测在DSB处组装的内源修复机制(Discover
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Seq[1])、将DNA标签序列整合到宿主细胞基因组中(GUIDE
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Seq；参见美国专利号9,822,407)、iGUIDE[2,3])或通过在体外切割DNA(BLISS[4]、CIRCLE
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Seq[5]、SiteSeq[6])。
[0008]细胞或基于细胞(有时被称为体内)和生物化学(有时被称为体外)脱靶测定提名系统各自具有其优点。与DNA和表观遗传标记结合的蛋白质修改核酸酶活性的功能，表明细胞或基于细胞的方法可能更好地鉴定实际的编辑靶[7]。然而，生物化学方法提名了通过细胞或基于细胞的方法未鉴定到的位点，表明生物化学方法可能更加全面[5，6]。然而，这些当前的工具往往具有不完美的灵敏度[5，6](参见图1)。
[0009]需要一种以提高的准确性和灵敏度检测和提名中靶和脱靶CRISPR编辑位点的方法。

技术实现思路

[0010]本文描述的一个实施方式是一种以提高的准确性和灵敏度鉴定和提名中靶和脱
靶CRISPR编辑位点的方法，所述方法包括下述步骤：(a)将引导序列RNA(sgRNA)或双组分CRISPR RNA：反式激活crRNA(crRNA：tracrRNA)双链体、一种或多种标签序列和RNA引导的核酸内切酶共同递送到细胞；(b)将所述细胞温育一个时间段，所述时间段足以使双链断裂发生；(c)从所述细胞分离基因组DNA，将所述基因组DNA片段化，并将片段化的基因组DNA连接到含有通用接头序列的独特分子索引；(d)使用靶向所述标签和通用接头序列的引物扩增所连接的DNA片段，以产生第一组扩增的序列；(e)使用靶向Tag
‑
pTOP或Tag
‑
pBOT引物尾部的通用测序引物扩增所述第一组扩增的序列，以产生第二组扩增的序列；(f)对合并的序列进行测序并获得测序数据；和(g)鉴定中靶/脱靶CRISPR编辑位点。在一种情况下，所述通用测序引物靶向Tag
‑
pTOP或Tag
‑
pBOT引物上的SP1或SP2序列(SEQ ID NO：7、8)尾部，以产生第二组扩增的序列。在另一种情况下，所述通用测序引物靶向Tag
‑
pTOP或Tag
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pBot引物上的预先设计的非同源序列(SEQ ID NO：269
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273)尾部，以产生第二组扩增的序列。在另一种情况下，所述通用测序引物靶向Tag
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pTOP或Tag
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pBot引物上的预先设计的13
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mer尾部，以产生第二组扩增的序列。在另一种情况下，步骤(g)包括在处理器上执行下述操作：(i)将所述测序数据与参考基因组比对；(ii)鉴定中靶/脱靶CRISPR编辑位点；和(iii)将所述比对、分析和结果数据作为自定义格式的文件、表格或图形输出。在另一种情况下，所述方法还在步骤(e)之后包括下述步骤：(e1)将所述第二组扩增的序列标准化以产生浓度标准化文库，将所述标准化文库与其他样品合并以产生合并文库；并继续进行步骤(f)
–
(i)。在另一种情况下，步骤(d)使用抑制PCR法。在另一种情况下，所述RNA引导的核酸内切酶包括内源表达的Cas酶、Cas表达载体、Cas蛋白或Cas RNP复合物。在另一种情况下，所述RNA引导的核酸内切酶包括内源表达的Cas9酶、Cas9表达载体、Cas9蛋白或Cas9 RNP复合物。在另一种情况下，所述细胞包括人类或小鼠细胞。在另一种情况下，所述时间段为约24小时至约96小时。在另一种情况下，将多种标签序列共同递送。在另一种情况下，所述标签序列包括包含52个碱基对的双链脱氧核糖寡核苷酸(dsDNA)。在另一种情况下，所述标签序列包含5
′‑
端磷酸和在第1与第2位、第2与第3位、第50与第51位和第51与第52位核苷酸之间的硫代磷酸酯连键。在另一种情况下，所述标签序列包括包含SEQ ID NO：1
–
2或7
–
268的互补的顶部和底部链对的双链DNA。
[0011]本文描述的其他实施方式是使用本文描述的方法鉴定或提名的中靶和脱靶CRISPR编辑位点。
[0012]本文描述的另一个实施方式是一种设计52个碱基对的标签序列的方法，所述方法包括在处理器上执行下述操作：(a)随机生成13个核苷酸的序列，其具有40
–
90％的GC含量，最大均聚物长度A:2、C:3、G:2、T:2，加权均聚物率<20，自折叠T
m
<50℃，并且自身二聚体T
m
<50℃；(b)移除与特定基因组完全对齐或者是均聚物或GG或CC二核苷酸基序的序列，并获得一组13
‑
mer；(c)选择所述13
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mer序列的含有一个或更少CC或GG二核苷酸基序的子集；(d)串联所述13
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mer子集序列中本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种以提高的准确性和灵敏度鉴定和提名中靶和脱靶CRISPR编辑位点的方法，所述方法包括下述步骤：(a)将引导序列RNA(sgRNA)或双组分CRISPR RNA：反式激活crRNA(crRNA：tracrRNA)双链体、一种或多种标签序列和RNA引导的核酸内切酶共同递送到细胞；(b)将所述细胞温育一个时间段，所述时间段足以使双链断裂发生；(c)从所述细胞分离基因组DNA，将所述基因组DNA片段化，并将片段化的基因组DNA连接到含有通用接头序列的独特分子索引；(d)使用靶向所述标签和通用接头序列的引物扩增所连接的DNA片段，以产生第一组扩增的序列；(e)使用靶向Tag
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pTOP或Tag
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pBOT引物尾部的通用测序引物扩增所述第一组扩增的序列，以产生第二组扩增的序列；(f)对合并的序列进行测序并获得测序数据；和(g)鉴定中靶/脱靶CRISPR编辑位点。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述通用测序引物靶向Tag
‑
pTOP或Tag
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pBOT引物上的SP1或SP2序列(SEQ ID NO：7、8)尾部，以产生第二组扩增的序列。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述通用测序引物靶向Tag
‑
pTOP或Tag
‑
pBot引物上的预先设计的非同源序列(SEQ ID NO：269
–
273)尾部，以产生第二组扩增的序列。4.根据权利要求1
‑
3中的任一项所述的方法，其中所述通用测序引物靶向Tag
‑
pTOP或Tag
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pBot引物上的预先设计的13
‑
mer尾部，以产生第二组扩增的序列。5.根据权利要求1
‑
4中的任一项所述的方法，其中步骤(g)包括在处理器上执行下述操作：(i)将所述测序数据与参考基因组比对；(ii)鉴定中靶/脱靶CRISPR编辑位点；和(iii)将所述比对、分析和结果数据作为自定义格式的文件、表格或图形输出。6.根据权利要求1
‑
5中的任一项所述的方法，其还在步骤(e)之后包括下述步骤：(e1)将所述第二组扩增的序列标准化以产生浓度标准化文库，将所述标准化文库与其他样品合并以产生合并文库；并继续进行步骤(f)
–
(i)。7.根据权利要求1
‑
6中的任一项所述的方法，其中步骤(d)使用抑制PCR法。8.根据权利要求1
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7中的任一项所述的方法，其中所述RNA引导的核酸内切酶包括内源表达的Cas酶、Cas表达载体、Cas蛋白或Cas RNP复合物。9.根据权利要求1
‑
8中的任一项所述的方法，其中所述RNA引导的核酸内切酶包括内源表达的Cas9酶、Cas9表达载体、Cas9蛋白或Cas9 RNP复合物。10.根据权利要求1
‑
9中的任一项所述的方法，其中所述细胞包括人类或小鼠细胞。11.根据权利要求1
‑
10中的任一项所述的方法，其中所述时间段为约24小时至约96小时。12.根据权利要求1
‑
11中的任一项所述的方法，其中将多种标签序列共同递送。13.根据权利要求1
‑
12中的任一项所述的方法，其中所述标签序列包括包含52个碱基对的双链脱氧核糖寡核苷酸(dsDNA)。14.根据权利要求1
‑
13中的任一项所述的方法，其中所述标签序列包含5
′‑
端磷酸和在
第1与第2位、第2与第3位、第50与第51位和第51与第52位核苷酸之间的硫代磷酸酯连键。15.根据权利要求1
‑
14中的任一项所述的方法，其中所述标签序列包括包含SEQ ID NO：1
–
2或7
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268的互补的顶部和底部链对的双链DNA。16.一种中靶和脱靶CRISPR编辑位点，其使用根据权利要求1
‑
15中的任一项所述的方法鉴定或提名。17.一种设计52个碱基对的标签序列的方法，所述方法包括在处理器上执行下述操作：(a)随机生成13个核苷酸的序列，其具有40
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90％的GC含量，最大均聚物长度A:2、C:3、G:2、T:2，加权均聚物率<20，自折叠T
m
<50℃，并且自身二聚体T
m
<50℃；(b)移除与特定基因组完全对齐或者是均聚物或GG或CC二核苷酸基序的序列，并获得一组13
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mer；(c)选择所述13
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【专利技术属性】
技术研发人员：马修，
申请(专利权)人：合成DNA技术公司，
类型：发明
国别省市：