脂质膜包裹的复合聚集体的纯化方法技术

一种从染色质杂聚物(包含样品中LMCA的降解残留物)中分离脂质膜包裹化合物聚集体(LMCA)的色谱法，

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】脂质膜包裹的复合聚集体的纯化方法
[0001]本专利技术涉及一种从染色质杂聚物(chromatin heteroaggregates)中分离脂质膜包裹的化合物聚集体(lipid
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membrane
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enclosed compound assemblages,LMCAs)的色谱法，所述染色质杂聚物包含样品中LMCAs的降解残留物。
技术背景
[0002]术语“复合聚集体(complex assemblage)”在生物学领域中指结构上组织化的实体，其含有多于一种的生物分子，并且通常含有多于一类的生物分子，例如蛋白质、碳水化合物和核酸等。一些复合聚集物被脂质膜包围，例如细胞囊泡，细胞外囊泡和脂质包被的病毒(lipid
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enveloped viruses)。大多数的尺寸范围在约30nm至约300nm，其中一些可达10倍或更大倍。
[0003]最近的实验表明，脂质膜包裹的化合物聚集体(lipid
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membrane
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enclosed compound assemblages,LMCAs)的未纯化制剂伴有一类包含其降解残留物的特殊污染物[1,2]。通过特定LMCA的特异性蛋白质标记物的免疫染色来检测它们。尺寸排阻色谱法表明，大多数此类残留物的尺寸范围为约2nm至约50nm。
[0004]染色质代表了细胞培养收获物中一类已知污染物。它由含有宿主细胞DNA和组蛋白的降解核小体阵列组成[3]。它通常继发结合RNA和其他蛋白质，从而产生杂聚物(heteroaggregates)，其中“杂聚物”一词被理解为多于一类生化物质的无组织复合物。已知细胞培养收获物中残留的染色质杂聚物存在于2nm至5微米以上的范围内。用0.45微米膜过滤可以将该范围的上限降低至约400nm。
[0005]最近的实验数据表明，染色质杂聚物的一特定子集包含LMCA的降解残留物[4]。这种染色质杂聚物的扩展类别由其包含的给定种类化合物聚集体的特征性LMCA膜蛋白标记物，连同其染色质成分中过量的表面可及核酸(surface
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accessible nucleic acids)限定。过量核酸的表面可及性是这些杂聚物的关键限定特征。许多种类的LMCA都包含核酸，但是只要LMCA保持完整，核酸就被包裹在脂质膜内。包含LMCA残留物的染色质杂聚物大小从小于100nm到大于1000nm不等[4]。
[0006]包含LMCA残留物的染色质杂聚物对治疗用LMCA的生产造成特殊的问题。这种杂聚物会导致免疫学测定中完整LMCA的表观含量被夸大。这对于通过LMCA膜蛋白识别LMCA的亲和色谱法来说也是问题，因为含有这些蛋白的染色质杂聚物也会被捕获。LMCA和含有LMCA残留物的染色质杂聚物的尺寸重叠也使得基于尺寸的纯化方法无法将它们分离。
[0007]阴离子交换色谱法有将LMCA与含有LMCA残留物的染色质杂聚物分离的潜力，但其用途仅限于外部由核酸残留物(1
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3)高度主导的杂聚物。此类杂聚物通常不会在氯化钠中洗脱，但完整的LMCA会被洗脱。表面具有较少量核酸的含有LMCA残留物的染色质杂聚物会与完整的LMCA共洗脱[4](图1)。这对LCMA治疗应用来说是重要的问题，因为全世界的监管机构都一直要求将污染的DNA减少到极低的水平。
[0008]有时LMCA会出现其他的纯化难点，即将外膜小叶中含有过量磷脂酰丝氨酸的LMCA和外膜小叶中缺乏磷脂酰丝氨酸的LMCA分开。外膜小叶中过量的磷脂酰丝氨酸是某一LMCA
源细胞发炎、感染、病变、垂死(dying)或死亡(dead)的指标[5]。目前还没有已知的色谱法可以将外膜表面没有磷脂酰丝氨酸的LCMA和外膜表面有磷脂酰丝氨酸的LCMA分离。
[0009]专利技术概述
[0010]本专利技术涉及从染色质杂聚物(包含样品中LMCA的降解残留物)中分离脂质膜包裹化合物聚集体(LMCA)的色谱法，该方法包括以下步骤：
[0011]‑
将样品与表面具有阳离子金属亲和配体的色谱材料接触，所述色谱材料带有三价铁、锰、钙或镁离子，并用平衡缓冲液平衡，
[0012]‑
施用梯度的含有非金属螯合盐的第一洗脱缓冲液，从而
[0013]‑
洗脱LMCA。
[0014]在本专利技术的方法的实施例中，LMCA可以选自：细胞囊泡、细胞外囊泡、非细胞囊泡、细胞器、外泌体、小细胞外囊泡、微囊泡，中细胞外囊泡、核糖体、线粒体、脂质包被的病毒或脂质包被的病毒样颗粒、流感病毒、冠状病毒、慢病毒、巨细胞病毒、脂质体及它们的组合。
[0015]在本专利技术方法的另一实施例中，非金属螯合盐是单价卤化物盐，特别是氯化钠。
[0016]在本专利技术方法的另一实施例中，所述样品可以是细胞培养收获物、已过滤的细胞培养收获物、已浓缩过滤的细胞培养收获物、含有LMCA和染色质杂聚物的部分纯化的制剂，所述染色质杂聚物包含LMCA残留物。
[0017]在本专利技术方法的另一实施例中，包含LMCA降解残留物的染色质杂聚物在含有螯合盐的第二洗脱缓冲液中梯度洗脱。
[0018]在本专利技术方法的另一实施例中，所述第二洗脱缓冲液的螯合盐选自：金属磷酸盐、或金属柠檬酸盐、或乙二胺四乙酸(EDTA)的金属盐、或乙二醇
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双(β
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氨基乙基醚)
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N，N，N'，N'
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四乙酸，也称为依他酸(egtazic acid,EGTA)的金属盐及它们的组合。
[0019]在本专利技术方法的另一实施例中，所述方法与至少一种减少染色质杂聚物含量的其他方法组合。
[0020]在本专利技术方法的另一实施例中，所述至少一种其他方法可以是用核酸酶处理和/或用带有阴离子色谱配体的固相处理。
[0021]在本专利技术的方法的另一实施例中，带有阴离子色谱配体的固相带有铁或锰离子。
[0022]在本专利技术方法的另一实施例中，样品与色谱材料接触，并在孵育时间后与色谱材料分离。
[0023]在本专利技术方法的另一实施例中，所述样品，特别是含有外泌体的细胞培养收获物可以通过切向流过滤进行渗滤。
[0024]在本专利技术方法的另一实施例中，所述阳离子金属亲和配体可以是三(2
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氨基乙基)胺(TREN)。
[0025]在本专利技术方法的另一实施例中，平衡缓冲液的pH范围在pH 5至pH 9，或pH 6至pH 8，或优选pH 6.5至pH 7.5之间，其电导率值为1mS/cm至250mS/cm，或2mS/cm至100mS/cm，或3mS/cm至50mS/cm，或4mS/cm至20mS/cm，或优选5mS/cm至10mS/cm。
[0026]本专利技术是从染色质杂聚物中分离完整的脂质膜包裹的化合物聚集体(LMCA)的色谱法，所述染色质杂聚物包含LMCA的降解残留物。令人惊讶的是，阳离子金属亲和配体优选带有三价铁或锰离子，可以与非金属螯合盐本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种从包含样品中LMCA的降解残留物的染色质杂聚物中分离脂质膜包裹化合物聚集体(LMCA)的色谱法，
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将样品与表面具有阳离子金属亲和配体的色谱材料接触，所述色谱材料带有三价铁、锰、钙或镁离子，并用平衡缓冲液平衡，
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施用梯度的含有非金属螯合盐的第一洗脱缓冲液，从而
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洗脱LMCA。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述LMCA选自：细胞囊泡、细胞外囊泡、非细胞囊泡、细胞器、外泌体、小细胞外囊泡、微囊泡、中细胞外囊泡、核糖体、线粒体、脂质包被的病毒或脂质包被的病毒样颗粒、流感病毒、冠状病毒、慢病毒、巨细胞病毒、脂质体及它们的组合。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述非金属螯合盐是单价卤化物盐，特别是氯化钠。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述样品是细胞培养收获物、已过滤的细胞培养收获物、已浓缩过滤的细胞培养收获物、含有LMCA和染色质杂聚物的部分纯化的制剂，所述染色质杂聚物包含LMCA残留物。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包含LMCA的降解残留物的染色质杂聚物在含有螯合盐的第二洗脱缓冲液中梯度洗脱。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述第二洗脱缓冲液的螯合盐选自：金属磷酸盐、或金属柠檬酸盐、或乙二胺四乙酸(EDTA)的金属盐、或乙二醇双(β
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【专利技术属性】
技术研发人员：P，
申请(专利权)人：赛多利斯比亚分离有限责任公司，
类型：发明
国别省市：