一种超微量琼脂糖凝胶纯化DNA试剂盒及纯化DNA的方法技术

本发明专利技术提供了一种超微量琼脂糖凝胶纯化DNA试剂盒及纯化DNA的方法，涉及生物技术领域，本发明专利技术的试剂盒包括：溶胶液、除杂液、漂洗液、洗脱缓冲液和离子吸附柱和收集管；所述除杂液包括4

【技术实现步骤摘要】
一种超微量琼脂糖凝胶纯化DNA试剂盒及纯化DNA的方法


[0001]本专利技术涉及生物
，具体而言，涉及一种超微量琼脂糖凝胶纯化DNA试剂盒及纯化DNA的方法。

技术介绍

[0002]纯化和分析DNA在分子生物学领域广泛运用，在基因克隆技术中，通常会对聚合链式反应扩增的产物进行回收、纯化和测序等分析；或者通过酶切环状质粒，对线性化质粒DNA进行回收纯化，用于后续的分子实验中。从琼脂糖凝胶中回收DNA片段的常见方法包括：DEAE—纤维素滤膜回收法、低熔点琼脂糖法、透析袋电洗、挖孔法等。但由于这些方法存在实验操作繁琐、DNA回收效率低和成本高等问题，柱式法回收DNA仍然是应用最广泛，操作效率高的一种方法。但柱式法回收DNA也有缺陷，如回收量低，如果需要回收大量核酸需要更多的吸附柱，现有吸附柱以二氧化硅羟基为主要材料，这是造成柱式法回收DNA成本高的主要原因。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的在于提供一种超微量琼脂糖凝胶纯化DNA试剂盒及纯化DNA的方法，以解决上述问题。为了实现上述目的，本专利技术采取的技术方案如下：
[0004]本申请提供了一种超微量琼脂糖凝胶纯化DNA试剂盒，其特征在于，包括：溶胶液、除杂液、漂洗液、洗脱缓冲液和离子吸附柱和收集管；所述除杂液包括4
‑
6M尿素、2
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3M NaCl和70％
‑
80％无水乙醇；所述离子吸附柱采用上下双层纳米膜，所述纳米膜具有一定的柔性和刚性，具有多个离子基团，耐强酸强碱、高盐和乙醇溶液。
[0005]进一步的，所述离子吸附柱上层纳米膜为聚碳酸酯膜，所述聚碳酸酯膜的微孔直径小于5nm，过滤尿素和NaCl；下层纳米膜为聚酰胺膜，所述聚酰胺膜含有亲水的酰胺基团，可以与DNA形成氢键而结合，达到拦截DNA的作用，氢键能力越强则DNA结合能力就越强，从而达到分离盐溶液和DNA目的。最后在高于漂洗液的pH条件下，即可将纯净DNA从所述纳米膜上洗脱。
[0006]进一步的，所述除杂液的浓度为5
‑
5.5M尿素、2.2M NaCl、70％无水乙醇。所述尿素可以使DNA上的非特异性蛋白成变性状态，能够很好地保护核酸的结构稳定。所述NaCl溶液溶解DNA，通过离心与蛋白质分离。70％无水乙醇洗涤DNA水相中的盐成分。
[0007]进一步的，所述溶胶液包括50
‑
100mM Tris
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HCl缓冲液和7％酚红溶液，所述Tris
‑
HCl缓冲液pH＝8.0，用于保护DNA的稳定性。
[0008]进一步的，所述7％酚红溶液配制方法为：称取0.1g的酚红置于研钵中，加入5.7ml 50mM NaOH溶液和适量的水，将酚红研碎，定容至250ml，4℃保存。酚红溶液作为酸碱指示剂，pH低于6.4时显示为黄色，利用酚红溶液的酸碱指示特性判断溶胶液是否变质以及观察溶胶效果和监测pH值变化，从而达到最佳结合效果，提高回收效率。
[0009]进一步的，所述漂洗液包括70％
‑
80％无水乙醇，pH＝7.5。70％
‑
80％无水乙醇可
有效去除盐溶液和其他杂质、沉淀DNA。
[0010]进一步的，所述洗脱缓冲液包括1mM
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3mM Tris
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HCl，pH＝8.0
‑
9.0，用于将纯净的DNA从所述纳米膜上洗脱，优选浓度为1mM。
[0011]一种纯化DNA的方法，包括步骤：
[0012]切胶：在长波紫外灯下，将目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下，尽量切除不含DNA的凝胶；
[0013]加入溶胶液：将目的DNA条带放入1.5ml离心管，加400
‑
500μL溶胶液；
[0014]溶胶：将离心管放置于50℃
‑
65℃水浴环境中，直至目的DNA条带完全溶解，在水浴期间每2
‑
3min混匀一次；
[0015]调节溶胶液：用NaOH溶液进行滴定调节溶胶液的pH，待溶胶液变成紫红色时停止滴定，此过程一方面为了稳定DNA的环境，另一方面在后续使用离心柱时用来激活离心吸附柱上的纳米膜，吸附DNA；
[0016]除杂：向混合液中加入500μL除杂液并混匀，然后12,000rpm离心1min，留上清溶液；
[0017]上柱：将所述上清溶液加入位于收集管内的离子吸附柱中，然后室温放置1min，最后12,000rpm，离心30s，弃废液；
[0018]漂洗：在所述离子吸附柱中加入600μL漂洗液12,000rpm离心30s，弃废液，再重复漂洗一次；
[0019]去除漂洗液：将所述离子吸附柱12,000rpm离心2min，弃废液，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应；
[0020]洗脱：将所述离子吸附柱从收集管取出放入一个新的离心管中，在所述离子吸附柱的中间部位加50μL洗脱液，室温放置2min，12,000rpm离心1min。
[0021]进一步的，所述琼脂糖凝胶中为PCR产物时，包括步骤：
[0022]切胶：在长波紫外灯下，将目的PCR条带从琼脂糖凝胶中切下；
[0023]加入溶胶液：将目的PCR条带放入1.5ml离心管，用水将PCR反应液或酶切反应液补足至100μL，加入300μL溶胶液混匀；
[0024]调节溶胶液：用NaOH溶液进行滴定调节溶胶液的pH，待溶胶液变成紫红色时停止滴定；
[0025]除杂：向混合液中加入500μL除杂液并混匀，然后12,000rpm离心1min，留上清溶液；
[0026]上柱：将所述上清溶液加入位于收集管内的离子吸附柱中，然后室温放置1min，最后12,000rpm，离心30s，弃废液；
[0027]漂洗：在所述离子吸附柱中加入600μL漂洗液12,000rpm离心30s，弃废液，再重复漂洗一次；
[0028]去除漂洗液：将所述离子吸附柱12,000rpm离心2min，弃废液；
[0029]洗脱：将所述离子吸附柱从收集管取出放入一个新的离心管中，在所述离子吸附柱的中间部位加50μL洗脱液，室温放置2min，12,000rpm离心1min。
[0030]本专利技术的有益效果为：
[0031]本专利技术通过独特的缓冲液体系和离心吸附柱法，用于琼脂糖凝胶DNA和PCR产物的
回收。采用尿素除杂，其毒性和成本远低于胍盐，专一性强，可以使DNA上的非特异性蛋白成变性状态，能够很好地保护核酸的结构稳定。本专利技术还提出了一种新的离子吸附柱的吸附膜，其成本低，吸附DNA的效果好，解决了现有离子吸附柱成本高的问题。因此本专利技术具有操作简单快捷、回收效率高、安全环保和成本低的显著优势。
[0032]本专利技术的其他特征和优点将在随后的说明书阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本专利技术实施例了解。本专利技术的目的和其本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种超微量琼脂糖凝胶纯化DNA试剂盒，其特征在于，包括：溶胶液、除杂液、漂洗液、洗脱缓冲液和离子吸附柱和收集管；所述除杂液包括4
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6M尿素、2
‑
3M NaCl和70％
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80％无水乙醇；所述离子吸附柱采用上下双层纳米膜。2.根据权利要求1所述的超微量琼脂糖凝胶纯化DNA试剂盒，其特征在于：所述离子吸附柱上层纳米膜为聚碳酸酯膜，下层纳米膜为聚酰胺膜。3.根据权利要求1所述的超微量琼脂糖凝胶纯化DNA试剂盒，其特征在于：所述聚碳酸酯膜的微孔直径小于5nm。4.根据权利要求1所述的超微量琼脂糖凝胶纯化DNA试剂盒，其特征在于：所述除杂液的浓度为5
‑
5.5M尿素、2.2M NaCl、70％无水乙醇。5.根据权利要求1所述的超微量琼脂糖凝胶纯化DNA试剂盒，其特征在于：所述溶胶液包括50
‑
100mM Tris
‑
HCl缓冲液和7％酚红溶液，所述Tris
‑
HCl缓冲液pH＝8.0。6.根据权利要求5所述的超微量琼脂糖凝胶纯化DNA试剂盒，其特征在于，所述7％酚红溶液配制方法为：称取0.1g的酚红置于研钵中，加入5.7ml 50mM NaOH溶液和适量的水，将酚红研碎，定容至250ml，4℃保存。7.根据权利要求1所述的超微量琼脂糖凝胶纯化DNA试剂盒，其特征在于：所述漂洗液包括70％
‑
80％无水乙醇，pH＝7.5。8.根据权利要求1所述的超微量琼脂糖凝胶纯化DNA试剂盒，其特征在于：所述洗脱缓冲液包括1mM
‑
3mM Tris
‑
HCl，pH＝8.0
‑
9.0。9.一种纯化DNA的方法，其特征在于，包括步骤：切胶：在长波紫外灯下，将目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下；加入溶胶液：将目的DNA条带放入1.5ml离心管，加400
‑
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【专利技术属性】
技术研发人员：李艳艳，
申请(专利权)人：核小体北京生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：