用于病毒载体生产的HEK293悬浮细胞系的开发方法技术

本发明专利技术涉及一种用于病毒载体生产的悬浮HEK293细胞系的开发方法。该方法包括以下步骤：将HEK293贴壁细胞以有限稀释法进行克隆筛选，获得180～250个细胞克隆；评估克隆筛选获得的细胞克隆的生长速率和病毒载体转染效率，筛选出15～25组待扩大培养的细胞克隆；将各组待扩大培养的细胞克隆分别扩大培养，并以生长速率和病毒载体转染效率筛选，获得5～13组作为悬浮驯化的优选克隆细胞；将各组优选克隆细胞分别进行悬浮驯化；及将经悬浮驯化的各组细胞分别取各自的一部分以病毒载体转染效率筛选，制备适宜于悬浮培养的HEK293细胞。上述方法时间短且获得的细胞的病毒产量高，可实现生物药的规模化生产。物药的规模化生产。物药的规模化生产。

【技术实现步骤摘要】
用于病毒载体生产的HEK293悬浮细胞系的开发方法


[0001]本专利技术涉及生物医药
，特别是涉及用于病毒载体生产的细胞系开发，具体涉及一种用于病毒载体生产的HEK293悬浮细胞系的开发方法。

技术介绍

[0002]目前，基因细胞治疗药物的开发如火如荼，用于嵌合抗原受体
‑
T细胞治疗(Chimeric Antigen Receptor T
‑
Cell Immunotherapy，CAR
‑
T)的病毒载体通常为慢病毒载体(LVVs)，用于基因治疗的病毒载体通常为腺相关病毒载体(AAV)或腺病毒载体(ADV)。慢病毒载体的生产通常使用HEK293T细胞，腺相关病毒载体或腺病毒载体的生产通常使用HEK293细胞，基于腺病毒载体的疫苗(如新冠疫苗)也使用的是HEK293细胞。此外，一些溶瘤病毒载体(OV)的和外泌体的生产通常也使用HEK293细胞。
[0003]早期的病毒载体生产工艺均使用的是贴壁细胞生产工艺，且当前慢病毒载体的生产大多仍使用的是贴壁细胞，而AAV和OV的生产也有一半以上是使用的贴壁细胞工艺。然而，贴壁细胞生产病毒载体通常依赖于胎牛血清(FBS)，这不仅增加了药物的安全风险(例如外源病毒因子污染等问题)，也增加了生产成本，同时FBS的批间差异可能对病毒载体生产的工艺一致性造成挑战。对于贴壁细胞生产工艺，另一个巨大的挑战是其难以实现规模化放大生产(通常只能到数十升/批)，这不仅增加了成本，也对工艺的稳定性和一致性造成巨大挑战。
[0004]随着生物技术以及生物工艺技术的进步，悬浮细胞生产工艺不断开发和优化。悬浮细胞生产工艺具有生产物料无动物源成分、易于规模放大(通常可达200L、500L、2000L)、成本低、生产工艺稳定性和一致性好、生产操作友好等优势。悬浮细胞生产工艺在整个生物制药行业应用广泛，尤其是抗体药物，已几乎全部使用悬浮细胞进行生产。一些慢病毒载体生产工艺逐渐使用悬浮HEK293T细胞，越来越多的AAV、ADV以及OV药物项目开始使用悬浮HEK293细胞进行病毒载体生产。
[0005]传统的HEK293细胞悬浮驯化策略为DMEM或EMEM和胎牛血清逐渐降低和替换，即血清浓度逐渐由10％降低至7.5％、5％、2.5％、1％，DMEM或EMEM也逐渐更换成悬浮培养的无血清培养基，然而此悬浮驯化过程漫长，通常需3～5个月完成。并且HEK293为人胚肾亚三倍体细胞，是一种染色体异质性很强的细胞。HEK293原始细胞生长缓慢，细胞转染效率不高，从而导致病毒载体滴度的单位产率较低。

技术实现思路

[0006]基于此，有必要提供一种悬浮HEK293细胞系开发时间短且病毒载体的产率高的用于病毒载体生产的HEK293悬浮细胞的开发方法。
[0007]用于病毒载体生产的HEK293悬浮细胞系的开发方法，包括以下步骤：
[0008]将HEK293贴壁细胞以有限稀释法进行克隆筛选，获得180个～250个细胞克隆；其中，所述克隆筛选的培养基包含VP
‑
SFM培养基和Pro293培养基中的一种、体积百分含量为
2％～10％的胎牛血清和2mM～8mM的GlutaMax
TM
补充剂；
[0009]评估所述克隆筛选获得的细胞克隆的生长速率和病毒载体转染效率，筛选出15组～25组待扩大培养的细胞克隆；
[0010]将各组所述待扩大培养的细胞克隆分别扩大培养，其中，所述扩大培养的培养基包含VP
‑
SFM培养基和Pro293培养基中的一种、体积百分含量为0％～2％的胎牛血清和2mM～8mM的GlutaMax
TM
补充剂；在扩大培养过程中，以生长速率和病毒载体转染效率筛选，获得5组～13组优选克隆细胞；
[0011]将各组所述优选克隆细胞分别进行悬浮驯化，其中所述悬浮驯化采用无血清完全培养基进行培养，所述无血清完全培养基包含SFM4 HEK293、SFM4 Transfx293、HEK293 MaxX、OPM 293 CD05、OptiVitro 293、HEK293
‑
04 Prototype、HEK293
‑
13 Prototype、HEK Vip NX、HEK Vip NB、HEK TF和HEK GM中的一种和2mM～8mM的GlutaMax
TM
补充剂；及
[0012]将经悬浮驯化的各组细胞分别取各自的一部分细胞，以病毒载体转染效率筛选，制备适宜于病毒载体生产用的HEK293悬浮细胞系。
[0013]上述用于病毒载体生产的HEK293悬浮细胞系的开发方法采用贴壁培养克隆筛选、悬浮驯化、悬浮细胞克隆筛选而获得适宜于病毒载体生产的HEK293悬浮细胞系。具体的，采用有限稀释法进行克隆后以转染效率和细胞生长速率进行评估，获得待悬浮驯化的细胞克隆；悬浮驯化利用HEK293贴壁细胞能在有血清或无血清的VP
‑
SFM培养基或Pro293培养基生长的特点进行快速悬浮驯化，其能够在3周～5周内将HEK293完成悬浮驯化，与传统悬浮驯化逐步减血清的方法需3～5个月相比，大大减少了悬浮驯化的时间。并且由于克隆筛选进行了转染效率评估，从而使得经克隆筛选和悬浮驯化的HEK293悬浮细胞系能以高密度高转染效率生产病毒载体，从而大大增加病毒产量。
[0014]在其中一个实施例中，在悬浮驯化之前，还包括从5组～13组优选克隆细胞中以生长速率和病毒载体转染效率筛选出3组～6组作为待悬浮驯化细胞。
[0015]在其中一个实施例中，所述克隆筛选的步骤包括：
[0016]将HEK293贴壁细胞以1个/孔的密度铺板进行初步培养，所述初步培养的孔数为900孔～2000孔；及
[0017]筛选出生长良好的180个～250个细胞克隆。
[0018]在其中一个实施例中，所述初步培养的步骤包括：
[0019]在将HEK293贴壁细胞贴壁培养6天～8天后，以一半体积的新鲜培养基进行换液，后续每3天～4天进行一次换液。
[0020]在其中一个实施例中，在评估病毒载体转染效率的步骤中，至少满足以下条件中的一个：
[0021](1)转染试剂包括PEIpro、PEI MAX或VirusGen；
[0022](2)转染试剂与病毒载体之比为(1～5)：1，病毒载体的用量为0.5μg/cm2～2μg/cm2；
[0023](3)病毒载体为AAV转移质粒或LV转移质粒。
[0024]在其中一个实施例中，所述悬浮驯化的步骤包括：
[0025]将各组所述优选克隆细胞的密度调整为0.8
×
106个/mL～1
×
106个/mL后，振荡培养，所述振荡培养的振幅为20mm～50mm、转速为95rpm～150rpm；及
[0026]在细胞密度低于1
×
106个/mL或细胞活率低于85％时，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于病毒载体生产的HEK293悬浮细胞系的开发方法，其特征在于，包括以下步骤：将HEK293贴壁细胞以有限稀释法进行克隆筛选，获得180个～250个细胞克隆；其中，所述克隆筛选的培养基包含VP
‑
SFM培养基和Pro293培养基中的一种、体积百分含量为2％～10％的胎牛血清和2mM～8mM的GlutaMax
TM
补充剂；评估所述克隆筛选获得的细胞克隆的生长速率和病毒载体转染效率，筛选出15组～25组待扩大培养的细胞克隆；将各组所述待扩大培养的细胞克隆分别扩大培养，其中，所述扩大培养的培养基包含VP
‑
SFM培养基和Pro293培养基中的一种、体积百分含量为0％～2％的胎牛血清和2mM～8mM的GlutaMax
TM
补充剂；在扩大培养过程中，以生长速率和病毒载体转染效率筛选，获得5组～13组优选克隆细胞；将各组所述优选克隆细胞作为待悬浮驯化细胞分别进行悬浮驯化，其中所述悬浮驯化采用无血清完全培养基进行培养，所述无血清完全培养基包含SFM4 HEK293、SFM4 Transfx293、HEK293 MaxX、OPM 293 CD05、OptiVitro 293、HEK293
‑
04 Prototype、HEK293
‑
13 Prototype、HEK Vip NX、HEK Vip NB、HEK TF和HEK GM中的一种和2mM～8mM的GlutaMax
TM
补充剂；及将经悬浮驯化的各组细胞分别取各自的一部分细胞，以病毒载体转染效率筛选，制备适宜于病毒载体生产用的HEK293悬浮细胞系。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在悬浮驯化之前，还包括从5组～13组优选克隆细胞中以生长速率和病毒载体转染效率筛选出3组～6组作为待悬浮驯化细胞。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述克隆筛选的步骤包括：将HEK293贴壁细胞以1个/孔的密度铺板进行初步培养，所述初步培养的孔数为900孔～2000孔；及筛选出生长良好的180个～250个细胞克隆。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述初步培养的步骤包括：在将HEK293贴壁细胞贴壁培养6天～8天后，以一半体积的新鲜培养基进行换液，后续每3天～4天进行一次换液。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在评估病毒载体转...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡迪超，华骏，张未萌，腾飞，王泱洲，丁树慧，张景森，
申请(专利权)人：苏州博腾生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：