一种小鼠原代肺成纤维细胞分离、纯化及体外激活模型构建的方法技术

本发明专利技术提供了一种小鼠原代肺成纤维细胞分离、纯化及体外激活模型构建的方法，主要包括如下步骤：小鼠肺的分离、肺成纤维细胞的分离、肺成纤维细胞的纯化、肺成纤维细胞体外激活模型的构建，得到肺成纤维细胞体外激活模型。本发明专利技术通过创新性联合使用差时贴壁法、差速贴壁法和细胞营养筛选法，可以避免原代细胞培养过程中混杂大量非成纤维细胞所带来的细胞筛选困难，该方法操作简便、效率高，无需昂贵仪器设备就可完成小鼠原代肺成纤维细胞分离、纯化及体外激活模型的构建，对于今后实验研究具有重要参考价值。具有重要参考价值。具有重要参考价值。

【技术实现步骤摘要】
一种小鼠原代肺成纤维细胞分离、纯化及体外激活模型构建的方法


[0001]本专利技术涉及细胞培养领域，尤其涉及一种小鼠原代肺成纤维细胞分离、纯化及体外激活模型构建的方法。

技术介绍

[0002]肺是人体呼吸系统中的关键器官，为呼吸过程的气体交换提供了重要场所。肺成纤维细胞是肺间质内的重要细胞组成，能激活成为肌成纤维细胞，从而合成并分泌细胞外基质蛋白，其增殖、迁移与转分化关系到肺部组织结构维持、肺部损伤后的修复和重塑，从而影响肺功能。
[0003]肺纤维化是一种慢性、进行性的不可逆间质性肺部病变，由环境、遗传和组织异常修复等多方面因素引起，以成纤维细胞的激活和增殖、细胞外基质的过度沉积和慢性间质性炎症为主要病理特征，同时也是许多肺部疾病发展的最终阶段。在确诊后，患者的存活时间通常仅为2
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4年。据统计，肺纤维化全球发病率为10
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60例/10万人/每年。有研究表明，2019年新型冠状病毒肺炎患者，尤其是重症感染者，在后期出现严重肺纤维化的概率显著增加。由于肺纤维化的主要临床表现为干咳及进行性加重的呼吸困难，一旦患病，患者的日常生活将长期受到严重的影响，患者最终也可因呼吸衰竭而死亡。
[0004]肺成纤维细胞的异常持续激活被认为是肺纤维化机制中的重要过程之一，通过小鼠肺成纤维细胞来模拟研究肺纤维化机制，可为人们提供治疗或改善肺纤维化的新思路，但目前小鼠原代肺成纤维细胞尚无有效的培养方法。
[0005]现有的培养方法之一：流式细胞分选或者免疫磁珠分选，需要昂贵仪器、磁珠和抗体，对实验条件、操作技术要求很高，经济型、便捷性很差。
[0006]若采用传统培养方法，如营养筛选法则需要等待细胞传代数代之后方能获取纯化原代成纤维细胞，大大减少成纤维细胞后续实验可利用代数；此外成纤维细胞增殖速度很慢，培养周期长。
[0007]综上所述，小鼠原代肺成纤维细胞培养亟须解决培养周期长，细胞纯化困难、价格高昂等难题。

技术实现思路

[0008]为了克服上述现有技术的不足，本专利技术提供了一种小鼠原代肺成纤维细胞分离、纯化及体外激活模型构建的方法。
[0009]为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：
[0010]一种小鼠原代肺成纤维细胞分离、纯化及体外激活模型构建的方法，包括如下步骤：
[0011]S1，小鼠肺的分离：选用8～10周的成年雄性小鼠，颈椎脱臼法处死后，固定于解剖板上，依次剪开表皮、腹膜、横膈膜，从胸骨处向两边打开胸腔，迅速摘除心脏后，上剪气管，
下剪食管，取出完整的肺至15mL离心管中备用；
[0012]S2，肺成纤维细胞的分离：在生物安全柜内，用PBS清洗肺组织，剥除气管、食管、周围结缔组织及残余血块，用眼科剪在6cm细胞培养皿中剪碎肺组织至呈糊状，时间控制在5min左右，用1
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2齿组织镊夹取肺组织块，并均匀铺在六孔板中，组织块之间间隔约3mm，期间适时滴加少量肺成纤维细胞完全培养基以保持组织暂时湿润；
[0013]S3，肺成纤维细胞的培养：待所有组织铺板完成，静置一定时间后，在六孔板中加入2mL完全培养基，置于培养箱中培养，在大约第3天，镜下可见组织块周围有卵圆形和长梭形的两种细胞爬出，此后每两天换一次液；
[0014]S4，肺成纤维细胞的纯化：在第七天，细胞的整体密度达到90％后，用0.25％胰酶消化1.5～2min，过200目细胞筛，1000rpm离心5min，弃上清，用完全培养基重悬肺成纤维细胞，接种在六孔板中，培养一定时间后，弃去培养基，加入新的完全培养基，37℃、5％CO2培养箱中培养得到纯化后的肺成纤维细胞；
[0015]S5，肺成纤维细胞体外激活模型的构建：纯化后的肺成纤维细胞过夜培养后，吸弃原有培养基，每孔加入2mL新鲜的肺成纤维细胞低血清培养基，并每孔加入3ng/mL的TGF
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β1，48h后得到肺成纤维细胞体外激活模型。
[0016]进一步的，所述完全培养基具有如下组分：33.6mL的H
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DMEM基础培养基、6mL的澳大利亚
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胎牛血清和0.4mL的双抗溶液。
[0017]进一步的，所述低血清培养基具有如下组分：39.4mL的H
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DMEM基础培养基、0.2mL的澳大利亚
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胎牛血清和0.4mL的双抗溶液。
[0018]进一步的，S2中，所述的六孔板提前30min用0.1％的明胶孵育。
[0019]进一步的，S3中，所述的静置时间为10min。
[0020]进一步的，S3中，所述培养箱培养条件为5％CO2、湿度为95％、温度为37℃。
[0021]进一步的，S4中，所述的培养箱培养时间为1h。
[0022]更进一步的，所述双抗溶液含10,000U/mL苄青霉素钠和10,000μg/mL链霉素。
[0023]与现有技术相比，本专利技术具有的有益效果是：
[0024]1.通过创新性联合使用差时贴壁法、差速贴壁法和细胞营养筛选法，该方法可以避免原代细胞培养过程中混杂大量非成纤维细胞所带来的细胞筛选困难。
[0025]2.便捷、周期短：该方法仅用容易获得的常规试剂便能达到超过传统方法的优良效果，通过采用0.1％的明胶提前孵育六孔板30min，提高细胞爬出的数量和缩短细胞爬出需要的时间；在肺组织块铺板10min后，再加入完全培养基，大大缩短了传统组织块法中等待组织块干涸所需时间；用含有15％澳大利亚胎牛血清(AUS
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FBS)的肺成纤维细胞完全培养基培养成纤维细胞，可使更多的肺成纤维细胞更早地爬出，并且更快地进入对数生长期；肺成纤维细胞传代后的1h换液，可以在尽可能多的肺成纤维细胞贴壁的前提下，除去暂未贴壁的杂质细胞；用仅含有0.5％澳大利亚胎牛血清(AUS
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FBS)的肺成纤维细胞低血清培养基培养成纤维细胞，可避免血清对生长因子作用的影响，成功构建肺成纤维细胞体外激活模型；TGF
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β1已经被证实是肺纤维化发生机制中的中心因子，也是成纤维细胞激活过程中的关键因子，以3ng/mL的TGF
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β1刺激肺成纤维细胞48h，经WB检测，3ng/mL与6ng/mL的TGF
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β1处理均可使得α
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SMA表达明显上调，激活效果显著，故选择3ng/mL TGF
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β1处理48h作为小鼠肺成纤维细胞激活模型的构建条件。
[0026]3.经济、方便：该方法操作简便、效率高，无需昂贵仪器设备就可完成小鼠原代肺成纤维细胞分离、纯化及体外激活模型的构建，对于今后实验研究具有重要参考价值。
附图说明
[0027]为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本专利技术的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种小鼠原代肺成纤维细胞分离、纯化及体外激活模型构建的方法，包括如下步骤：S1，小鼠肺的分离：选用8～10周的成年雄性小鼠，颈椎脱臼法处死后，固定于解剖板上，依次剪开表皮、腹膜、横膈膜，从胸骨处向两边打开胸腔，迅速摘除心脏后，上剪气管，下剪食管，取出完整的肺至15mL离心管中备用；S2，肺成纤维细胞的分离：在生物安全柜内，用PBS清洗肺组织，剥除气管、食管、周围结缔组织及残余血块，用眼科剪在6cm细胞培养皿中剪碎肺组织至呈糊状，时间控制在5min左右，用1
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2齿组织镊夹取肺组织块，并均匀铺在六孔板中，组织块之间间隔约3mm，期间适时滴加少量肺成纤维细胞完全培养基以保持组织暂时湿润；S3，肺成纤维细胞的培养：待所有组织铺板完成，静置一定时间后，在六孔板中加入2mL完全培养基，置于培养箱中培养，在大约第3天，镜下可见组织块周围有卵圆形和长梭形的两种细胞爬出，此后每两天换一次液；S4，肺成纤维细胞的纯化：在第七天，细胞的整体密度达到90％后，用0.25％胰酶消化1.5～2min，过200目细胞筛，1000rpm离心5min，弃上清，用完全培养基重悬肺成纤维细胞，接种在六孔板中，培养一定时间后，弃去培养基，加入新的完全培养基，37℃、5％CO2培养箱中培养得到纯化后的肺成纤维细胞；S5，肺成纤维细胞体外激...

【专利技术属性】
技术研发人员：柳全文，赵楚瑜，徐欣鎏，顾皓铖，周嘉欣，应研敏，周婕，
申请(专利权)人：南昌大学，
类型：发明
国别省市：