一种裂解昆虫细胞及哺乳动物细胞的裂解液和裂解方法技术

本发明专利技术提供一种昆虫细胞及哺乳动物细胞的裂解液、裂解液获取方法及细胞裂解方法，通用性地对含AAV1～13等多种血清型的细胞中进行高效原位裂解，宿主细胞包括昆虫细胞和哺乳动物细胞，收率95%以上，全程操作无需转移料液或离心等，细胞裂解后，经过深层过滤或切向流过滤获得AAV细胞澄清液，具有收率高的特点，获得AAV细胞澄清液还可用于后续层析提纯，该方法可用于生产上大规模线性放大的收获rAAV细胞澄清液。胞澄清液。

【技术实现步骤摘要】
一种裂解昆虫细胞及哺乳动物细胞的裂解液和裂解方法


[0001]本专利技术涉及生物
，特别是涉及一种裂解昆虫细胞及哺乳动物细胞的裂解液和裂解方法。

技术介绍

[0002]重组腺病毒相关病毒(rAAV)是一类单链线状DNA缺陷型微小病毒，具有良好的安全性，低免疫原性，高特异性，高稳定性，作用时间持久的特点，现已经成为体内基因治疗递送的主要工具。不论是昆虫细胞还是HEK293哺乳动物细胞表达的rAAV，都主要存在于细胞内，从细胞收获液中高效便捷的提取含AAV的细胞澄清液以成为亟需解决的问题。传统裂解细胞方法以反复冻融，低pH为主，需要经过离心，才能收集细胞澄清液，存在处理时间长，操作繁琐，裂解不充分，容易造成产品的聚集，收率较低。

技术实现思路

[0003]本专利技术所要解决的技术问题是：为了克服现有技术中的不足，本专利技术提供一种昆虫细胞及哺乳动物细胞的裂解液、裂解液获取方法及裂解方法。
[0004]本专利技术解决其技术问题所要采用的技术方案是：一种昆虫细胞及哺乳动物细胞的裂解液，所述裂解液的组分包括Tris、MgCl2、Tween20和NaCl，配制的裂解液中各组分为：Tris
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HCL
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50mMMgCl2
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5 mMNaCl
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0.3
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0.6MTween 20
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0.5
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2%(1g/100ml)配制的裂解液pH值为7.6
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8.3。
[0005]一种昆虫细胞及哺乳动物细胞裂解液的获取方法，包括以下步骤：步骤1：选取多种经典裂解试剂配制含有不同组分、不同浓度的缓冲体系裂解液；步骤2：将含有腺相关病毒的细胞收获液加入到不同组分的缓冲体系裂解液中进行裂解，控制料液的转速、温度和pH值，在裂解过程的不同时段进行取样；步骤3：检测裂解前后料液的细胞活率、浊度和AAV滴度，根据检测结果选取出对细胞裂解具有促进作用裂解试剂作为配制裂解液的初选组分；步骤4：改变初选组分中不同裂解试剂的浓度，进行裂解效果的比较，检测裂解后料液的细胞活率、密度、滴度、pH和电导，根据检测结果进一步筛选，并且确定出不同裂解试剂的浓度和比例；其中，腺相关病毒选自AAV1~13中任意一种或多种。
[0006]作为优选，步骤1中选取的经典裂解试剂包括Tris 、Tween20、NaCl、MgCl2、Poloxamer188、Sodium deoxycholate、T riton X
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100中的一种或几种。
[0007]作为优选，步骤3中的特征参数包括细胞活率、浊度、AAV滴度、细胞密度、pH值、电导中的一种或多种。
[0008]一种昆虫细胞及哺乳动物细胞的裂解方法，包括以下步骤：步骤1：裂解前取样20ml含有腺相关病毒的细胞收获液检测初始细胞活率、浊度和细胞密度；步骤2：将裂解液定量，即量出相应体积的细胞收获液，便于核算所需要的裂解用量。
[0009]步骤3：打开超净工作台的照明与通风开关，在超净工作台中用电动移液枪添加裂解液与核酸酶到细胞收获液中，在37℃，100
‑
200rpm的裂解条件下，裂解1
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3h；步骤4：对裂解后的料液进行深层过滤或切向流过滤获得AAV细胞澄清液。
[0010]具体的，步骤3中添加裂解液的方式包括配制裂解母液和顺序添加裂解试剂两种方式，其中，裂解母液方式，首先，将裂解试剂按照浓度和比例配制成裂解母液，然后再按比例将裂解母液添加到细胞收获液中；顺序添加裂解试剂方式：首先，准备好需要添加的裂解试剂，然后按照先后顺序将各种裂解试剂添加至细胞收获液中。
[0011]作为优选，所述核酸酶的加入量为5
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50U/ml。
[0012]进一步，步骤4中深层过滤的方法，将裂解后收获的样品直接进行一、二级膜包深层过滤，过滤压力≤14 psi，当压力大于14 psi时，停止上样并用缓冲液顶洗20L/m2；根据剩余料液体积，换上新的一、二级深层过滤膜包，并将两次收获的料液混合后进行0.2 um 或0.45 um 滤膜过滤。
[0013]具体的，深层过滤的方法具体包括以下步骤：步骤4.1：根据滤器载量和所需过滤体积计算所需一级过滤膜包和二级过滤膜包的面积；步骤4.2：将一级过滤膜包和二级过滤膜包安装在滤器的管路上，并在一级过滤膜包和二级过滤膜包的进口管道上安装压力检测器，在一级过滤膜包的进液口连接注射水，在一级过滤膜包的出液口连接废液瓶；步骤4.3：设置合适的泵速，打开排气管路上出气口的管夹，启动泵排出管路中空气，将一级过滤膜包内的气泡排尽后暂停泵，并关闭出气口和出液口管夹；然后，再次启动泵用单位膜包面积为50 L/m2以上的注射水冲洗一级过滤膜包；然后，采用相同的方法对二级过滤膜包进行排气和清洗；步骤4.4：清洗完成后，将进液口插入样品瓶进行上样，排废4 L/m2~6 L/m2之后，开始收集滤出液；步骤4.5：上样结束后，采用深滤平衡液把剩余样品顶出滤器，获得顶出液，根据一级过滤膜包和二级过滤膜包面积，顶洗用深滤平衡液用量为10L/m2的深滤平衡液；从而提高回收率。
[0014]步骤4.6：混匀滤出液与顶洗液后，取样20ml检测浊度、滴度并计算载量和收率。
[0015]进一步，为了了解裂解液的裂解效果，还包括以下步骤：对步骤3中裂解后的料液取样进行滴度、活率、细胞密度、浊度、pH及电导的检测，分析裂解效果，从而可以后期对裂解液进行调整，以进一步提高裂解效果。
[0016]本专利技术的有益效果是：本专利技术提供的一种裂解昆虫细胞及哺乳动物细胞的裂解
液、裂解液获取方法及裂解方法，通用性地对含AAV1～13等多种血清型的细胞中进行高效原位裂解，宿主细胞包括昆虫细胞（如sf9）和哺乳动物细胞（如HEK293），收率95%以上，全程操作无需转移料液或离心等，细胞裂解后，经过深层过滤或切向流过滤获得AAV细胞澄清液，具有收率高的特点，获得AAV细胞澄清液还可用于后续层析提纯，该方法可用于生产上大规模线性放大的收获rAAV细胞澄清液。
具体实施方式
[0017]为了更直观的说明本专利技术的技术路线，现在对本专利技术作详细的说明。
[0018]本专利技术的昆虫细胞及哺乳动物细胞裂解液的获取方法，其设计思路为：以经典裂解试剂组分汇总配方为对照，从汇总配方中删减不同裂解试剂，评估删减特定试剂对裂解效果的影响。
[0019]具体过程如下：步骤1：选取多种经典裂解试剂配制含有不同组分、不同浓度的缓冲体系裂解液；本实施例中经典裂解试剂选取了7种分别为：Tris 、Tween20、MgCl2、Poloxamer188、NaCl、Sodium deoxycholate和T riton X本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种昆虫细胞及哺乳动物细胞的裂解液，其特征在于：所述裂解液的组分包括Tris、MgCl2、Tween20和NaCl，配制的裂解液中各组分为：Tris
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HCL
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50mMMgCl2
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5 mMNaCl
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0.3
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0.6MTween 20
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0.5
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2%配制的裂解液pH值为7.6
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8.3。2.一种昆虫细胞及哺乳动物细胞裂解液的获取方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤1：选取多种经典裂解试剂配制含有不同组分、不同浓度的缓冲体系裂解液；步骤2：将含有腺相关病毒的细胞收获液加入到不同组分的缓冲体系裂解液中进行裂解，控制料液的转速、温度和pH值，在裂解过程的不同时段进行取样；步骤3：检测裂解前后料液的细胞活率、浊度和AAV滴度，根据检测结果选取出对细胞裂解具有促进作用裂解试剂作为配制裂解液的初选组分；步骤4：改变初选组分中不同裂解试剂的浓度，进行裂解效果的比较，检测裂解后料液的细胞活率、密度、滴度、pH和电导，根据检测结果进一步筛选，并且确定出不同裂解试剂的摩尔浓度；其中，腺相关病毒选自AAV1~13中任意一种或多种。3.如权利要求2所述的昆虫细胞及哺乳动物细胞裂解液的获取方法，其特征在于：步骤1中选取的经典裂解试剂包括Tris 、Tween20、Poloxamer188、NaCl、Sodium deoxycholate、MgCl2、Triton X
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100中的一种或几种。4.如权利要求2所述的昆虫细胞及哺乳动物细胞裂解液的获取方法，其特征在于：步骤3中的特征参数包括细胞活率、浊度、AAV滴度、细胞密度、pH值、电导中的一种或多种。5.一种昆虫细胞及哺乳动物细胞的裂解方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤1：裂解前取样20ml含有腺相关病毒的细胞收获液检测初始细胞活率、浊度和细胞密度；步骤2：将细胞收获液定量；步骤3：打开超净工作台的照明与通风开关，在超净工作台中用电动移液枪添加裂解液与核酸酶到细胞收获液中，在37℃，100
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【专利技术属性】
技术研发人员：章成昌，张骥，孙永越，李杰，张雅，张劲松，孔令洁，钱浩，
申请(专利权)人：苏州博腾生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：