一种制备腮腺炎减毒活疫苗的方法技术

本发明专利技术涉及一种制备腮腺炎减毒活疫苗的方法，属于生物医药技术领域。本发明专利技术提供了一种制备腮腺炎减毒活疫苗的方法，所述方法包括澄清步骤，澄清步骤使用连续流离心，于固定离心力为4000~14000g、上样速度为400~1500mL/min的条件下，对腮腺炎病毒减毒株的病毒收获液进行澄清；与现有腮腺炎减毒活疫苗的澄清方法（滤膜过滤和绢布过滤）相比，所述方法澄清效果更稳定，自动化程度更高，操作更简便，更容易实现无菌操作，有助于降低腮腺炎减毒活疫苗的质量安全风险，并且，所述方法对病毒收获液中残留的细胞碎片的去除效果最佳，对病毒收获液中感染性腮腺炎病毒滴度的影响最小，有助于获得高病毒滴度的腮腺炎减毒活疫苗。得高病毒滴度的腮腺炎减毒活疫苗。得高病毒滴度的腮腺炎减毒活疫苗。

【技术实现步骤摘要】
一种制备腮腺炎减毒活疫苗的方法


[0001]本专利技术涉及一种制备腮腺炎减毒活疫苗的方法，属于生物医药


技术介绍

[0002]流行性腮腺炎是由腮腺炎病毒（Mumps virus，MuV）引起的急性传染病，是儿童和青少年期常见的呼吸道传染病。其主要临床症状为腮腺肿痛，有时也会引起诸如病毒性脑炎、睾丸炎、胰腺炎或卵巢炎等急性炎症或者全身性炎症。
[0003]MuV主要通过唾液、唾液污染的物品以及空气飞沫传播。流行性腮腺炎属于全球流行传染病中的一种，地区分布非常广泛。腮腺炎的流行和爆发无明显的季节和地域性，且不受气候等因素的影响，但是冬春季的发病人数要多于夏季。现阶段，控制流行性腮腺炎的主要措施是疫苗预防免疫。腮腺炎减毒活疫苗是用于控制流行性腮腺炎的疫苗中的重要产品。在腮腺炎减毒活疫苗大量使用以前，全球各地的腮腺炎疫情泛滥；但是随着腮腺炎减毒活疫苗的广泛使用，腮腺炎的发病率被极大的控制。
[0004]腮腺炎减毒活疫苗的制备过程主要包括腮腺炎病毒减毒株的规模化生产（细胞制备+病毒接种+细胞换液+病毒收获）以及腮腺炎病毒减毒株收获液的澄清两个步骤。其中，规模化生产得到高滴度的腮腺炎病毒减毒株收获液是腮腺炎减毒活疫苗批量化制备的前提条件，而应用先进的澄清技术对腮腺炎病毒减毒株收获液进行后处理是提高疫苗效力降低副反应的关键环节，两者都会直接影响到腮腺炎减毒活疫苗的质量和产量。
[0005]现阶段，主要通过转瓶工艺实现腮腺炎病毒减毒株的规模化生产，以及，主要使用过滤工艺（使用多层200目绢布过滤，或者，分别用不同截留量的超滤膜进行二级过滤）实现腮腺炎病毒减毒株收获液的澄清。其中，转瓶工艺存在很多缺陷，例如，单个转瓶的细胞饲养面积有限，规模化生产需要大量转瓶，无菌控制风险更高；受操作手法等因素影响，可能漏液，造成规模化制备方法效果无法保障；厂房所用空间更大，相同体积的收获液，相较于细胞工厂需要更大的空间；转瓶的清洗和灭菌需要大量劳动力，收换液等操作自动化替代难度较大。同时，腮腺炎病毒减毒株收获液的澄清方法也存在很多影响其澄清效果和效率的缺陷，例如，用于过滤的滤膜或者绢布需要灭菌，包扎，工序繁琐，对操作要求较高；受操作手法等因素影响，可能漏液，造成澄清效果无法保障；澄清效果可能受滤膜或者绢布批次差异，不同批次的绢布，其孔径大小存在批间差异，另外滤膜一般为多次使用，需要每次对完整性进行验证；不易进行大规模澄清，使用滤膜和绢布对于单次过滤量要求较高，当单次量过大，同批次先过滤的质量较佳，后续由于杂质的累积，造成滤膜或者绢布的阻塞，影响局部的过滤效果，进而可能造成局部压力过大，破坏病毒的结构。克服上述缺陷对进一步提高腮腺炎减毒活疫苗的质量和产量十分重要。

技术实现思路

[0006]为解决现有的制备腮腺炎减毒活疫苗的方法存在的问题，本专利技术提供了一种制备腮腺炎减毒活疫苗的方法，所述方法包括澄清步骤；所述澄清步骤为：使用连续流离心，于
固定离心力为4000~14000g、上样速度为400~1500mL/min的条件下，对腮腺炎病毒减毒株的病毒收获液进行澄清。
[0007]在本专利技术的一种实施方式中，所述澄清步骤为：使用连续流离心，于固定离心力为7000~12000g、上样速度为500~1300mL/min的条件下，对腮腺炎病毒减毒株的病毒收获液进行澄清。
[0008]在本专利技术的一种实施方式中，所述连续流离心的温度为2~8℃。
[0009]在本专利技术的一种实施方式中，澄清步骤前，所述方法还依次包括细胞制备步骤、病毒接种步骤、细胞换液步骤以及病毒收获步骤；所述细胞制备步骤为：制备鸡胚成纤维细胞悬液；所述病毒接种步骤为：将腮腺炎病毒减毒株接种至鸡胚成纤维细胞悬液中后，添加至含有病毒生长液的细胞工厂中进行第一次培养；所述细胞换液步骤为：第一次培养后，将细胞工厂中的病毒生长液导出，用缓冲液清洗细胞工厂；细胞表面清洗结束后，将细胞维持液注入细胞工厂中进行第二次培养；所述病毒收获步骤为：第二次培养结束后，对细胞工厂中的病毒培养液进行收获，得到腮腺炎病毒减毒株的病毒收获液；所述收获总共为三次或四次，每次收获间隔22~26h。
[0010]在本专利技术的一种实施方式中，所述收获包括如下步骤：第一次收获：第二次培养结束后，将细胞工厂中的病毒培养液导出，并将细胞维持液注入细胞工厂中进行第三次培养；第二次收获：第三次培养结束后，将细胞工厂中的病毒培养液导出，并将细胞维持液注入细胞工厂中进行第四次培养；第三次收获：第四次培养结束后，将细胞工厂中的病毒培养液导出，并与第一次收获和第二次收获得到的病毒培养液合并，即得腮腺炎病毒减毒株的病毒收获液；所述第三次培养和第四次培养的时间为22~26h。
[0011]在本专利技术的一种实施方式中，所述收获包括如下步骤：第一次收获：第二次培养结束后，将细胞工厂中的病毒培养液导出，并将细胞维持液注入细胞工厂中进行第三次培养；第二次收获：第三次培养结束后，将细胞工厂中的病毒培养液导出，并将细胞维持液注入细胞工厂中进行第四次培养；第三次收获：第四次培养结束后，将细胞工厂中的病毒培养液导出，并将细胞维持液注入细胞工厂中进行第五次培养；第四次收获：第五次培养结束后，将细胞工厂中的病毒培养液导出，并与第一次收获、第二次收获、第三次收获得到的病毒培养液合并，即得腮腺炎病毒减毒株的病毒收获液；所述第三次培养、第四次培养和第五次培养的时间为22~26h。
[0012]在本专利技术的一种实施方式中，所述第一次培养的时间为22~26h；所述第二次培养的时间为66~80h。
[0013]在本专利技术的一种实施方式中，所述细胞制备步骤为：将孵化9~11日龄的鸡胚剪碎，加入胰酶进行消化后吹打，得到鸡胚成纤维细胞悬液。
[0014]在本专利技术的一种实施方式中，所述细胞制备步骤为：将孵化9~11日龄的鸡胚，去头
去内脏，使用剪刀剪成1~3mm3的组织块后，以4~6mL/枚鸡胚的添加量加入胰酶，于36~38℃下消化15~25min，消化后进行吹打，制备成浓度为1.7~2.5
×
106个/mL的鸡胚成纤维细胞悬液。
[0015]在本专利技术的一种实施方式中，所述病毒接种步骤为：将腮腺炎病毒减毒株按照0.001~0.01MOI的接种量接种至鸡胚成纤维细胞悬液中后，将接种有腮腺炎病毒减毒株的细胞悬液以150~250mL/层的添加量加入到细胞工厂中，于33~35℃下进行第一次培养；细胞工厂的每层均添加有150~250mL病毒生长液。
[0016]在本专利技术的一种实施方式中，所述细胞换液步骤为：第一次培养22~26h后，将细胞工厂中的病毒生长液导出，用缓冲液清洗细胞工厂，每层加液100~200mL，晃动清洗细胞表面后将液体导出；细胞表面清洗结束后，将细胞维持液注入细胞工厂中，每层加液150~250mL，于33~35℃下培养进行第二次培养。
[0017]在本专利技术的一种实施方式中，所述缓冲液为0.01M、pH 7.4的PBS缓冲液。
[0018]在本专利技术的一种实施方式中，所本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种制备腮腺炎减毒活疫苗的方法，其特征在于，所述方法包括澄清步骤；所述澄清步骤为：使用连续流离心，于固定离心力为4000~14000g、上样速度为400~1500mL/min的条件下，对腮腺炎病毒减毒株的病毒收获液进行澄清。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述澄清步骤为：使用连续流离心，于固定离心力为7000~12000g、上样速度为500~1300mL/min的条件下，对腮腺炎病毒减毒株的病毒收获液进行澄清。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述连续流离心的温度为2~8℃。4.如权利要求1~3任一项所述的方法，其特征在于，澄清步骤前，所述方法还依次包括细胞制备步骤、病毒接种步骤、细胞换液步骤以及病毒收获步骤；所述细胞制备步骤为：制备鸡胚成纤维细胞悬液；所述病毒接种步骤为：将腮腺炎病毒减毒株接种至鸡胚成纤维细胞悬液中后，添加至含有病毒生长液的细胞工厂中进行第一次培养；所述细胞换液步骤为：第一次培养后，将细胞工厂中的病毒生长液导出，用缓冲液清洗细胞工厂；细胞表面清洗结束后，将细胞维持液注入细胞工厂中进行第二次培养；所述病毒收获步骤为：第二次培养结束后，对细胞工厂中的病毒培养液进行收获，得到腮腺炎病毒减毒株的病毒收获液；所述收获总共为三次或四次，每次收获间隔22~26h。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述收获包括如下步骤：第一次收获：第二次培养结束后，将细胞工厂中的病毒培养液导出，并将细胞维持液注入细胞工厂中进行第三次培养；第二次收获：第三次培养结束后，将细胞工厂中的病毒培养液导出，并将细胞维持液注入细胞工厂中进行第四次培养；第三次收获：第四次培养结束后，将细胞工厂中的病毒培养液导出，并与第一次收获和第二次收获得到的病毒培养液合并，即得腮腺炎病毒减毒株的病毒收获液；所述第三次培养和第四次培养的时间为22~26h。6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述收获包括如下步骤：第一次收获：第二次培养结束后，将细胞工厂中的病毒培养液导出，并将细胞维持液注入细胞工厂中进行第三次培养；第二次收获：第三次培养结束后，将细胞工厂中的病毒培养液导出，并将细胞维持液注入细胞工厂中进行第四次培养；第三次收获：第四次培养结束后，将细胞工厂中的病毒培养液导出，并将细胞维持液注入细胞工厂中进行第五次培养；第四次收获：第五次培养结束后，将细胞工厂中的病毒培养液导出，并与第一次收获、第二次收获、第三次收获得到的病毒培养液合并，即得腮腺炎病毒减毒株的病毒收获液；所述第三次培养、第四次培养和第五次培养的时间为22~26h。7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述第一次培养的时间为22~26h；所述第二次培养的时间为66~80h。8.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述细胞制...

【专利技术属性】
技术研发人员：安祺，田大勇，张亚静，张楠，
申请(专利权)人：北京赛尔富森生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：